Fullt Human tumor-baserte Matrix i tredimensjonale spheroid Invasion analysen

1. generering av flercellede tumor Spheroids Merk: Protokollen er demonstrert her med UT-SCC-42A og-42B cellelinjer, men det kan også brukes ved hjelp av andre cellelinjer. Vask UT-SCC-42A og-42B celler med 6 mL fosfat-bufret saltvann (PBS), tilsett 0,05% Trypsin-EDTA (3 mL for 75 cm2 kolbe), og plasser flasken i en cellekultur inkubator (37 ° c, 5% co2, 95% fuktighet) for 2-5 min. Kontroller at cellene har løsnet under et mikroskop. Deretter legger komplett Dulbecco ‘ s modifiserte Eagle ‘ s medium (DMEM) Media (DMEM + 10% fosterets storfe serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 250 ng/mL amfotericin B, 0,4 μg/mL Hydrocortisone, og 50 μg/mL askorbinsyre) for å nøytralisere enzymet (6 mL for 75 cm 2 kolbe) og overføre celle suspensjonen til en 15 ml konisk rør.Merk: Velg cellekultur mediet som passer til cellene som blir studert. Sentrifuger celle fjæringen ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og suspendere celle pellet i 2-5 mL komplett DMEM. Telle cellene og fortynne celle suspensjonen med komplett DMEM til en endelig konsentrasjon av 20 000 celler/mL.Merk: Optimal celle telling må fastsettes for hver cellelinje. Dispensere 50 μL av celle fjæringen i hver ultra-lav feste 96-vel rund bunnplate godt for en endelig konsentrasjon av 1 000 celler per brønn. Overfør platen til cellekultur inkubator (37 ° c, 5% CO2, 95% fuktighet). Fire dager senere, visuelt bekrefte tumor spheroid formasjon med en invertert mikroskop og fortsette med analysen. Sørg for at det bare er én spheroid per brønn.Merk: Tiden det tar å danne en spheroid, varierer mellom ulike cellelinjer. 2. tredimensjonal spheroid invasjon analysen Merk: Forbered 2x løsning fordi gelen vil bli fortynnet 1:1 når den legges inn i brønnene. Tin HMDM på is og fibrinogen lagerløsning i et vannbad opprettholdt ved 37 ° c. Ikke forstyrr fibrinogen før det er helt solubilized og ikke sette løsningen på isen; nedbør vil forekomme. Bland sammen riktig volum for hver reagens: 1 mg/mL HMDM (endelig konsentrasjon: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL trombin (endelig konsentrasjon: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL aprotinin (endelig konsentrasjon: 33,3 UG/mL), og 1 mg/mL fibrinogen (endelig konsentrasjon: 0,5 mg/mL ).Merk: Tilsett fibrinogen like før blandingen inn i brønnene og arbeid raskt; det vil danne en gel i noen minutter. Behandle bare noen få brønner om gangen. Tilsett 50 μL av gelen i hver brønn. Direkte spissen mot innsiden veggen av brønnen og Pipet langsomt. Unngå luftbobler (ved hjelp av omvendt pipettering teknikk) og prøv å ikke flytte spheroid fra midten av brønnen. Returner platen tilbake til cellen kultur inkubator og la HMDM/fibrin matrise å stivne i 30 min, og forsiktig legge til 100 μL av komplette DMEM i hver brønn på toppen av gel. 3. avbildning Bilde spheroids daglig ved hjelp av en invertert lys mikroskop. Alternativt kan du bruke automatiske bilde systemer. 4. bilde segmentering med Ilastik Åpne ilastik og velg piksel klassifiserings arbeidsflyt (figur 1A). Den klassifiserer pikslene basert på merknader brukeren har gjort. Lagre ilastik prosjekt (. ILP) på datamaskinen. Legg til bilder for analyser. Klikk på inn data og Legg til ny , og velg deretter bilder (figur 1B). For funksjonsvalg klikker du funksjonsvalg og utvalgte funksjoner (figur 1C, rødt rektangel).Merk: de valgte funksjonene bør grovt tilsvare de visuelle egenskapene som skiller objektene fra bakgrunnen, og de vil bli brukt til å trene klassifisereren. Velg funksjoner ved å klikke boksene. De valgte boksene vil bli grønne (figur 1C, blått rektangel).Merk: Her kan brukeren velge mellom flere forskjellige funksjonstyper og skalaer. Farge/intensitet bør velges for å skille objekter basert på farge eller lysstyrke. Kant bør velges for å skille objekter basert på lysstyrke eller fargegraderinger. Texture er en viktig funksjon hvis objektene i bildet har en spesiell textural utseende. For denne analysen brukes farge/intensitet (Sigma 0) og Edge (Sigma 6). For opplæring, klikk opplæring og i opplæring-delen er det to etiketter: etikett 1 og etikett 2 (figur 1D, rødt rektangel). Hvis det bare er én etikett, legger du til en ny etikett ved å trykke på Legg til etikett (figur 1D, blått rektangel). Merk bakgrunnen med en av etikettene (figur 1d, gul) og cellene med den andre etiketten (figur 1D, blå). Tren programvaren for de første 10% av bildene. Velg Neste bilde fra gjeldende visning. Når cellene og bakgrunnen er merket (i det første bildet), trykker du Live Update (figur 1D, lilla rektangel).Merk: med det neste bildet vil ilastik automatisk utføre analysen i henhold til tidligere bilder. Etter trening er gjort og ilastik har analysert alle bilder, klikk prediksjon Export. Velg enkel segmentering fra kilde; Ikke Velg sannsynligheter eller noe annet (figur 1E). Velg ønsket utdataformat fra Velg Eksporter bildeinnstillinger… i delen prediktiv eksport (figur 1E). Eksporter resultatene av merkingen ved å klikke på Eksporter alle (figur 1F). Filene vil bli eksportert til den samme mappen med de opprinnelige bildene.Merk: i dette eksperimentet brukes. H5-format. 5. areal analyse med Fiji ImageJ Skaler innstilling Åpne det opprinnelige bildet med en skala bar i Fiji ImageJ (figur 2a). Kontroller at bildet har samme størrelse og dimensjon som de analyserte bildene. Bruk linje markeringsverktøyet til å tegne en linje med en kjent lengde (figur 2B).Merk: Denne protokollen er utført ved hjelp av Fiji ImageJ 1,51 (64-bit) og ilastik-1.3.2 RC. Klikk analyser og Angi skala (figur 2C). Angi den kjente avstanden i feltet kjent avstand , og angi riktig enhet og klikk på global (figur 2D). Installere makroen Hvis en plugin ilastik ikke er installert, følger du denne fremgangsmåten: Klikk Hjelp, oppdatering…. På det åpne vinduet ImageJ Updater, klikk på Administrer oppdaterings områder. I det åpne vinduet Behandle oppdaterings områder, klikk Neste for å Ilastik klikk deretter Lukk. Deretter klikker du på Bruk endringer i vinduet ImageJ Updater. Denne prosessen kan ta litt tid. Det neste vinduet vil være informasjon med teksten oppdatert vellykket. Falle i staver OK og hvile ImageJ. Klikk på plugins, makroerog Installer (Figur 3A). Velg deretter Counter. ijm-filen (se tilleggsinformasjon) og klikk på Åpne.Merk: Makroen ble skrevet spesielt for å måleområdet. Makroen bør installeres hver gang programvaren åpnes. Areal analyse Analyser bilder når alle plugins er installert. Klikk plugins og bla ned til ilastik (Figur 3C). Velg IMPORTER HDF5, velg filen med. H5-format, klikk Åpne og Last inn og påfør lut (Figur 3C, D). Trykk på a -knappen fra tastaturet (makro) og området vil vises i Oppsummerings vinduet som totalt areal (Figur 3E).