ट्यूमर microenvironment कैंसर के विकास और आक्रमण का एक अनिवार्य हिस्सा है । कार्सिनोमा प्रगति की नकल करने के लिए, एक जैविक रूप प्रासंगिक मानव मैट्रिक्स की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल में एक मानव leiomyoma आधारित मैट्रिक्स लागू करके इन विट्रो तीन आयामी गोलाभ आक्रमण परख के लिए एक सुधार का परिचय । प्रोटोकॉल भी एक कंप्यूटर आधारित सेल आक्रमण विश्लेषण का परिचय ।
दो आयामी कोशिका संस्कृति आधारित assays है सामांयतः में इन विट्रो कैंसर अनुसंधान में उपयोग किया जाता है । हालांकि, वे कई बुनियादी तत्वों है कि ट्यूमर microenvironment फार्म की कमी है । विट्रो परिणामों में और अधिक विश्वसनीय प्राप्त करने के लिए, कई तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति assays हैं पेश किया गया है. ये assays हैं, कैंसर कोशिकाओं extracellular मैट्रिक्स के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देते हैं । इस बातचीत के प्रसार और आक्रमण के रूप में सेल व्यवहार को प्रभावित करता है, साथ ही साथ कोशिका morphology. इसके अतिरिक्त, इस बातचीत के लिए प्रेरित या कई समर्थक और विरोधी tumorigenic अणुओं की अभिव्यक्ति को दबा सकता है । Spheroid आक्रमण परख कैंसर सेल आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त 3 डी में विट्रो विधि प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था । वर्तमान में, पशु व्युत्पंन matrices, जैसे माउस सार्कोमा व्युत्पंन मैट्रिक्स (msdm) और चूहे की पूंछ प्रकार मैं कोलेजन, मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे है गोलाभ आक्रमण assays हैं । मानव ट्यूमर microenvironment और पशु व्युत्पंन matrices के बीच मतभेदों को ध्यान में रखते हुए, एक मानव myoma व्युत्पंन मैट्रिक्स (HMDM) सौम्य गर्भाशय leiomyoma ऊतक से विकसित किया गया था । यह दिखाया गया है कि hmdm प्रवास और कार्सिनोमा कोशिकाओं के आक्रमण msdm से बेहतर लाती है । इस प्रोटोकॉल एक सरल, reproducible, और विश्वसनीय 3 डी मानव ट्यूमर आधारित गोलाभ आक्रमण hmdm का उपयोग परख/ इसमें इमेजिंग और विश्लेषण पर विस्तृत निर्देश भी शामिल हैं । Spheroids एचएमएमडीएम के भीतर एक U-आकार अल्ट्रा कम लगाव प्लेट में वृद्धि/ आक्रमण दैनिक imaged, मापा जाता है, और ilastik और फिजी ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया । परख मंच मानव स्वरयंत्र प्राथमिक और मेटास्टेटिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा सेल लाइनों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । हालांकि, प्रोटोकॉल भी अंय ठोस कैंसर सेल लाइनों के लिए उपयुक्त है ।
पारंपरिक दो आयामी (2 डी) कोशिका संस्कृति के अध्ययन में काफी कैंसर अनुसंधान के लिए योगदान दिया है । वर्तमान में, शोधकर्ताओं को और अधिक तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति assays है की ओर स्थानांतरित कर रहे है बेहतर करने के लिए vivo में1शर्तों की नकल । 3 डी कैंसर कोशिका संस्कृति और अधिक सही कोशिका कोशिका और सेल मैट्रिक्स बातचीत, जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल, दवा संवेदनशीलता, और संकेतन मार्ग गतिविधि2,3के मामले में जटिल ट्यूमर microenvironment को दर्शाता है ।
कई 3 डी कोशिका संस्कृति मॉडल कैंसर अनुसंधान में इस तरह के ट्यूमर ऊतक explant, एक चिप पर ट्यूमर के रूप में उपयोग किया जाता है, और बहु कोशिकीय ट्यूमर spheroids3,4। बहुकोशिकीय ट्यूमर spheroids अब व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, के रूप में वे मानव ट्यूमर1,5में vivo में स्थितियों में कई सुविधाओं की नकल । जब गोलाभ व्यास ५०० μm से अधिक है, यह भी hypoxic क्षेत्रों और एक परिगलित केंद्र है, इस प्रकार vivo में ट्यूमर स्थिति2का प्रतिनिधित्व ।
कई सिंथेटिक (जैसे, polydimethylsiloxane) और पशु व्युत्पन्न (जैसे, चूहा पूंछ प्रकार मैं कोलेजन और माउस सार्कोमा व्युत्पंन मैट्रिक्स, matrigel, एमएसडीएम के रूप में संदर्भित) matrices3डी सेल संस्कृति के लिए विकसित किया गया है assays हैं,6, 7,8. इस प्रकार अभी तक, कोई भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध matrices मानव ट्यूमर ऊतक से उत्पंन हुआ है । इसलिए, वे मानव ट्यूमर microenvironment है, जो कैंसर सेल आक्रमण8प्रक्रियाओं पर महत्वपूर्ण प्रभाव है की सुविधाओं की कमी है ।
Myogel (मानव myoma-मैट्रिक्स व्युत्पंन, HMDM के रूप में संदर्भित) मानव गर्भाशय leiomyoma ट्यूमर ऊतक9से निकाला जाता है । यह दर्शाया गया है कि एचएमडीएम के प्रोटीन की मात्रा एमएसडीएम से काफी भिन्न है । दरअसल, एचएमडीएम प्रोटीन का ६६ प्रतिशत एमएसडीएम प्रोटीन से अलग होता है । दूसरी ओर, कुछ प्रोटीन, जैसे laminin, प्रकार चतुर्थ कोलेजन, heparan सल्फेट proteoglycans, nidogen, और एपिडर्मल विकास कारक, दोनों matrices10में मौजूद हैं । इसके अतिरिक्त, माउस एंजाइम सामग्री में मानव से अलग है, मनुष्य के साथ ७८ कम proteases11चूहों से ।
Fibrin व्यापक रूप से किया गया है अकेले या एक पाड़ सामग्री12के रूप में अंय सामग्री के साथ संयोजन में । 3 डी कोशिका संस्कृति में assays हैं, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन एक फाइफ़िन हाइड्रोजेल12फार्म के लिए संयुक्त कर रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन पहले से शुरू की एक सुधार 3 डी ट्यूमर गोलाभ आक्रमण परख7। इस नए प्रोटोकॉल पर लागू होता है मानव ट्यूमर व्युत्पंन मैट्रिक्स के बजाय माउस व्युत्पंन ट्यूमर मैट्रिक्स । यह भी इमेजिंग और विश्लेषण तकनीकों का उपयोग कर ilastik और फिजी ImageJ सॉफ्टवेयर शामिल है । इस प्रोटोकॉल कई अलग ठोस कैंसर सेल लाइनों के गोलाभ परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उपन्यास विरोधी कैंसर चिकित्सा विकसित करने के लिए और कैंसर सेल आक्रमण पर विशिष्ट अणुओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक जैविक रूप से प्रासंगिक उपकरण प्रदान करता है ।
प्रस्तुत विधि एक 3 डी मानव ट्यूमर आधारित परख के लिए मानव ट्यूमर microenvironment नकल उतार मैट्रिक्स के भीतर कैंसर कोशिकाओं की invasiveness का मूल्यांकन प्रदान करता है । कैंसर कोशिका आक्रमण आसानी से एक मानक माइक्रोस्कोप के साथ दैनिक इमेजिंग द्वारा मापा जा सकता है और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके । विधि केवल प्रसार के बजाय कोशिका आक्रमण को दर्शाता है ।
एमएसडीएम के विपरीत, HMDM/फाइफ़िन मैट्रिक्स किसी भी तापमान नियंत्रण की आवश्यकता नहीं है । इस विधि का प्रदर्शन करने के लिए आसान है, विशेष रूप से आवश्यकता के बिना एक थाली से दूसरे करने के लिए spheroids हस्तांतरण करने के लिए । यह केवल एक तकनीकी रूप से संवेदनशील कदम है, मैट्रिक्स को फाइब्रिनोजेन के अलावा । के बाद से फाइनोजेन कुछ मिनट के बाद जेल के लिए शुरू होता है, जोड़ने फाइब्रिनोजेन मजबूत pipetting और एक समय में केवल कुछ कुओं के उपचार की आवश्यकता है । अगर पिपीटिंग हाई ब् लड प्रेशर तरीके से की जाए तो स्लाभ को परेशान करने और उसे यू-आकार के कुएं में अपनी केंद्रीय स्थिति से हिलाने का भी खतरा होता है । गोलाभ की अव्यवस्था इमेजिंग और अंततः विश्लेषण जटिल कर सकते हैं ।
परख HMDM या fibrinogen की एकाग्रता में फेरबदल द्वारा संशोधित किया जा सकता है । कोशिकाओं को भी तय किया जा सकता है और बाद में आणविक अध्ययन के लिए दाग । हालांकि इस विधि को एक पूरी तरह से स्वचालित रूप से संशोधित किया जा सकता है, यह भी एक सामांय खुर्दबीन और दो खुले स्रोत सॉफ्टवेयर के साथ बाहर किया जा सकता है, महंगा उपकरण के लिए कोई ज़रूरत नहीं के साथ ।
पारंपरिक MSDM की तुलना में 3 डी assays आधारित है, इस परख बेहतर सेल आक्रमण संपत्तियों को प्रदर्शित कर सकता है । ऐसे MSDM के रूप में एक तहखाने झिल्ली युक्त laminin-रिच मैट्रिक्स, में उगाया spheroids, वास्तविक आक्रमण से कैंसर की कोशिकाओं के अधिक प्रसार हो सकता है, यह आक्रमण के लिए अनुपयुक्त प्रदान कई कैंसर कोशिका में उनके कम हमलावर क्षमता के कारण लाइनों में assays हैं । एक और अक्सर इस्तेमाल किया मैट्रिक्स, प्रकार मैं कोलेजन, को 3 डी खेती के दौरान किनारों से सिकुड़ जाता है, जो गोलाभ स्थानीयकरण और कुओं की इमेजिंग को प्रभावित करता है । इसके अतिरिक्त, अधिक (HSC-3) और कम (SCC-25) आक्रामक जीभ कार्सिनोमा सेल लाइनों के आंतरिक इनवेसिव गुणों के बीच अंतर मानव ट्यूमर microenvironment मॉडल (myoma डिस्क और इसके घुलनशील रूप का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है मैट्रिक्स)10,13।
परख भी MSDM का उपयोग कर के बाद से अधिक नैतिक है HMDM मानव leiomyoma ट्यूमर के बचे हुए सामग्री से निकाला जाता है । वर्तमान में, hmdm ही उपलब्ध मानव ट्यूमर व्युत्पंन ecm उत्पाद है कि कई कैंसर के लिए उपयुक्त प्रतीत होता है में विट्रो assays है8,10। भविष्य में, पशु ऊतक व्युत्पंन matrices मानव ट्यूमर आधारित matrices द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता करने के लिए मैट्रिक्स उत्पादन के लिए पशुओं के बलिदान की जरूरत को कम ।
2 डी कोशिका संस्कृति की जगह 3 डी तरीकों के साथ assays हैं कैंसर सेल व्यवहार पर अधिक सटीक जानकारी प्रदान करता है । वर्तमान में, वहां कई 3D मॉडल और वाणिज्यिक matrices हैं, लेकिन, दुर्भाग्य से, कोई भी सभी कैंसर सेल लाइनों के लिए उपयुक्त हैं । शोधकर्ताओं ने अपने विशेष परख के लिए सबसे उपयुक्त मैट्रिक्स का चयन करना चाहिए । परख और मैट्रिक्स के इष्टतम मिलान चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन यह काफी परिणाम की विश्वसनीयता बढ़ा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस अध्ययन के funders धंयवाद: Sigrid Jusélius फाउंडेशन, फिनलैंड के कैंसर सोसायटी, और हेलसिंकी विश्वविद्यालय के केंद्रीय अस्पताल अनुसंधान कोष । लेखकों तकनीकी मदद के लिए हेलसिंकी विश्वविद्यालय में Biomedicum इमेजिंग इकाई स्वीकार करते हैं ।
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |