Tumor mikromiljø er en væsentlig del af kræft vækst og invasion. For at efterligne karcinomer er der behov for en biologisk relevant menneskelig matrix. Denne protokol introducerer en forbedring for in vitro tredimensionel sfæroide invasion assay ved at anvende en human leiomyoma-baseret matrix. Protokollen introducerer også en computer-baseret celle invasion analyse.
To-dimensionelle cellekultur-baserede analyser er almindeligt anvendt i in vitro-kræftforskning. Men, de mangler flere grundlæggende elementer, der danner tumor mikromiljø. For at opnå mere pålidelige in vitro resultater, er flere tredimensionale (3D) cellekultur analyser blevet introduceret. Disse analyser tillade kræftceller til at interagere med den ekstracellulære matrix. Denne interaktion påvirker celle adfærd, såsom spredning og invasion, samt cellernes morfologi. Desuden kan denne interaktion inducere eller undertrykke udtrykket af flere Pro-og anti-tumorigene molekyler. Spheroid invasion assay blev udviklet til at give en passende 3D in vitro-metode til at studere kræft celle invasion. I øjeblikket, animalske afledte matricer, såsom mus sarkom-afledt matrix (MSDM) og Rottehale type I kollagen, anvendes hovedsageligt i sfæide invasion assays. Under hensyntagen til forskellene mellem den menneskelige tumor mikromiljø og animalske afledte matricer, en menneskelig myoma-afledt matrix (HMDM) blev udviklet fra benign livmoderen leiomyoma væv. Det er blevet påvist, at HMDM inducerer migration og invasion af karcinom celler bedre end MSDM. Denne protokol gav en enkel, reproducerbar og pålidelig 3D menneskelige tumor-baserede sfæroide invasion assay ved hjælp af hmdm/fibrin matrix. Den indeholder også detaljerede instruktioner om billeddannelse og analyse. Sfæroider vokser i en U-formet ultra-lav fastgørings plade inden for HMDM/fibrin-matrixen og invaderer den. Invasionen er dagligt indpakket, målt, og analyseret ved hjælp af ilastik og Fiji ImageJ software. Analyse platformen blev påvist ved hjælp af humane laryngeale primære og metastatiske planocellulært celle karcinom cellelinjer. Men, protokollen er velegnet også til andre solide kræft cellelinjer.
Konventionelle to-dimensionelle (2D) cellekultur undersøgelser har bidraget betydeligt til kræftforskning. I øjeblikket, forskere er ved at flytte mere i retning af tredimensionale (3D) cellekultur analyser at bedre efterligne in vivo betingelser1. 3D Cancer cellekulturen mere præcist afspejler den komplekse tumor mikromiljø i form af celle-celle-og celle-matrix interaktioner, genekspression profiler, stof følsomhed, og signalering pathway aktivitet2,3.
Flere 3D cellekultur modeller anvendes i kræftforskning såsom tumor væv explant, tumor på en chip, og fler cellulære tumor sfæroider3,4. Flercellede tumor sfæroider er nu almindeligt anvendt, da de efterligner flere funktioner i in vivo betingelser i human tumorer1,5. Når sfæroide diameter er større end 500 μm, det har endda hypoksiske regioner og en nekrotisk Center, der repræsenterer således in vivo tumor situation2.
Mange syntetiske (f. eks. Polydimethylsiloxan) og animalske afledte (f. eks. Rottehale type I kollagen og mus sarkom-afledt matrix, matrigel, benævnt MSDM) matricer er blevet udviklet til 3D cellekultur analyser3,6, 7,8. Hidtil har ingen af de kommercielt tilgængelige matricer stammer fra humant tumor væv. Derfor, de mangler funktionerne i den menneskelige tumor mikromiljø, som har betydelige virkninger på kræft celle invasion processer8.
Myogel (Human myoma-afledt matrix, benævnt HMDM) er udvundet fra humant uterus leiomyoma tumor væv9. Det er påvist, at proteinindholdet i HMDM afviger betydeligt fra MSDM. Faktisk er 66% af HMDM-proteinerne forskellige fra MSDM-proteiner. På den anden side, nogle proteiner, såsom Laminin, type IV kollagen, dermatansulfat sulfat proteoglycans, nidogen, og epidermal vækstfaktor, er til stede i begge matricer10. Derudover, musen adskiller sig fra det menneskelige i enzym indhold, med mennesker, der har 78 færre proteaser end mus11.
Fibrin er blevet anvendt i vid udstrækning alene eller i kombination med andre materialer som stilladset materiale12. I 3D cellekultur analyser kombineres kommercielt tilgængeligt humant fibrinogen og thrombin for at danne en fibrin hydrogel12.
Denne protokol beskriver en forbedring af den tidligere indførte 3D tumor sfæroide invasion assay7. Denne nye protokol gælder Human tumor-afledte matrix i stedet for muse afledte tumor matrix. Det indebærer også billedbehandling og analyseteknikker ved hjælp af ilastik og Fiji ImageJ software. Denne protokol kan anvendes til sfæroide assay af flere forskellige solid Cancer cellelinjer. Det tilbyder et biologisk relevant værktøj til at udvikle nye anti-cancer terapier og til at studere virkningerne af specifikke molekyler på kræft celle invasion.
Den præsenterede metode giver en 3D menneskelige tumor-baserede assay til at evaluere invasivitet af kræftceller inden for menneskelige tumor mikromiljø efterligne matrix. Kræft celle invasion kan let måles ved daglig billeddannelse med et standard mikroskop og ved hjælp af billedanalyse software. Metoden demonstrerer celle invasion snarere end blot spredning.
I modsætning til MSDM kræver HMDM/fibrin-matrixen ingen temperaturkontrol. Denne metode er let at udføre, især uden at det er nødvendigt at overføre sfæroider fra en plade til en anden. Det har kun et teknisk følsomt trin, tilsætning af fibrinogen til matrixen. Da fibrinogen begynder at gel efter et par minutter, kræver tilsætning af fibrinogen robust pipettering og behandling af kun få brønde ad gangen. Der er også en risiko for at forstyrre sfæide og flytte den fra sin centrale position i U-formet godt, hvis pipettering sker i en højtryks-måde. Dislokation af sfæroide kan komplicere billeddannelse og i sidste ende analysen.
Analysen kan modificeres ved at ændre koncentrationen af HMDM eller fibrinogen. Cellerne kan også fastgøres og farves for efterfølgende molekylære undersøgelser. Selvom denne metode kan ændres til en fuldt automatiseret form, kan den også udføres med et normalt mikroskop og to open source-software, uden behov for dyrt udstyr.
Sammenlignet med de traditionelle MSDM-baserede 3D-assays, denne analyse kunne vise bedre celle invasion egenskaber. Spheroids dyrket i en kælder membran-indeholdende Laminin-rige matrix, såsom MSDM, kan have mere spredning af kræftceller end faktiske invasion, gør det uegnet til invasion analyser i flere kræft cellelinjer på grund af deres lave invaderende kapacitet. En anden hyppigt anvendte matrix, type I kollagen, har tendens til at krympe fra kanterne under 3D dyrkning, som påvirker sfæroide lokalisering og billeddannelse af brøndene. Desuden er forskellene mellem de iboende invasive egenskaber af de mere (HSC-3) og mindre (SCC-25) aggressiv tungen karcinom cellelinjer er blevet påvist ved hjælp af menneskelige tumor mikromiljø efterligne modeller (myoma skiver og dens opløselig form matrix)10,13.
Analysen er også mere etisk end at bruge MSDM, da HMDM er udvundet fra resterne materiale af human leiomyoma tumor. I øjeblikket er hmdm den eneste tilgængelige Human tumor-afledte ECM produkt, der synes at være egnet til mange kræft-relaterede in vitro-analyser8,10. I fremtiden, animalske vævs afledte matricer kunne erstattes af humane tumor-baserede matricer for at reducere behovet for at ofre dyr til matrix produktion.
Udskiftning 2D cellekultur analyser med 3D-metoder giver mere præcise oplysninger om kræft celle adfærd. I øjeblikket er der flere 3D-modeller og kommercielle matricer, men desværre er ingen egnet til alle kræft cellelinjer. Forskerne bør vælge den mest egnede matrix for deres særlige assay. Optimal matchning af assay og matrix kan være udfordrende, men det kan øge resultaternes pålidelighed betydeligt.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker denne Studies finansieringskilder: Sigrid Jusélius Foundation, den finske Cancer forening og Helsinki University central hospitals forskningsfonde. Forfatterne anerkender Biomedicum Imaging Unit ved universitetet i Helsinki for teknisk hjælp.
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |