Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass

1. Zellkultur am 1. Tag Hinweis: Jede Probe für die Stoffwechselextraktion sollte aus einer einzigen 100-mm-Gewebekulturschale zubereitet werden, die mäßig, aber nicht vollständig verwirrend ist (mit etwa 2 – 5 Millionen Zellen). Berechnen Sie die Anzahl der für den Test benötigten Gerichte und bereiten Sie sie entsprechend vor. Kultur HCC827 und PC-9-Zellen in 5% CO 2 bei 37 ° C in RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10% fetalen Rinderserum (FBS). Aspiration die Zellkulturmedien aus den 100-mm-Kulturgerichten. Waschen Sie Zellen auf jeder Schüssel mit 2 ml Phosphat-gepufferten Saline (PBS) Lösung ohne Kalzium und Magnesium. Jedes Gericht sanft rocken, so dass die PBS-Lösung die Oberfläche der Schale vollständig abdeckt. Den Waschpuffer aus den Kulturgerichten aufsaugen. Warm 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung auf 37 ° C und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung mit einer 5 mL serologischen Pipette hinzufügen. Jedes Gericht so sanft felsen, dass die Trypsin die Oberfläche der Schüssel vollständig bedeckt. Die Kulturgerichte bei 37 ° C ca. 5 min einverwöhnen. Fügen Sie 4 ml vorgewärmtes komplettes Wachstumsmedium pro Schüssel hinzu. Die Zellen in Medium wiederbeleben, indem Sie mehrmals sanft pipettieren. Jede Zellaufhängung auf ein separates 15 mL konisches Rohr und Zentrifuge mit 800 × g für 5 min übertragen. Resuspend jedes Zellpellet in 2 mL vorgewärmtem Gesamtwachstumsmedium. Bestimmen Sie die Gesamtzahl und die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen mit dem automatisierten Zellzähler und 0,4% trypan blauer Lösung. Mischen Sie 10 μL Zellaufhängung und 10 μL von 0,4% Trypan Blue-Lösung. Laden Sie 10 μL Probe in die Zellzählkammer rutschen durch Kapillarwirkung. Legen Sie den Kammerrutsch in den automatisierten Zellzähler. Das übertragene Licht leuchtet automatisch aus und das Instrumentenauto konzentriert sich auf die Zelle. Klicken Sie auf die Aufnahmetaste, um das Bild zu erfassen und die Ergebnisse anzuzeigen. Wenn nötig, fügen Sie ein weiteres Wachstumsmedium hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten. Saatgut sind etwa 1 – 2,5 Millionen Zellen pro 100 mm Zellkulturschale.Hinweis: Die durch die CE-MS-Analyse ermittelten Stoffwechselkonzentrationen werden auf der Grundlage der Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert. Für die Zellzählung ist es notwendig, für jede Gruppe mindestens ein zusätzliches Saatgut zuzubereiten. Die Kulturgerichte in 5% CO 2 bei 37 ° Cfür 18 Stunden anfärmen. 2. Zubereitung von Reagenzien Verdünnen Sie eine kommerzielle interne Standardlösung mit L-Methion-Sulfon und D-Camphor-10-Sulfonsäure 1000-fach in ultrareinem Wasser. Hinweis: Für weniger als 80 Proben einfach 50 μL der internen Standardlösung 1 und 45 ml ultrareines Wasser in eine 50 ml volumetrische Flasche mischen, dann die Lösung bis zu 50 ml mit ultrareinem Wasser mitbringen. Bereiten Sie eine 0,05 g/mL Mannitol-Lösung in ultrareinem Wasser als Waschpuffer vor.Achtung: Für weniger als 30 Proben einfach 25 g Mannitol in 500 ml ultrareines Wasser auflösen. Pro 100 mm Kulturschale werden ca. 15 ml Waschpuffer benötigt, so dass je nach Anzahl der Proben ein ausreichendes Volumen an Waschpuffer erstellt wird. 3. Vorwasch-Zentrifugalfiltereinheiten Pipette 250 μL ultrareines Wasser in die Filterbecher jeder Zentrifugalfiltereinheit (siehe Materialtabelle).Achtung: Pro Probe werden zwei Filtereinheiten benötigt. Die Filtereinheiten fest und zentrifuge bei 9,100 × g bei 4 ° C für 5 min fest und zentrifuge. Überprüfen Sie das Volumen jedes Filtrats — wenn sich bei der ersten kurzen Drehung signifikantes Filtrat angesammelt hat, kann die Filtereinheit defekt sein. In diesem Fall die Filtereinheit ablegen und stattdessen eine neue Filtereinheit verwenden. Schließen Sie die Deckel der Filtereinheiten fest und zentrifuge bei 9,100 × g bei 4 ° C für 30 min wieder. Achten Sie darauf, dass in keinem der Filterbecher ultrareines Wasser verbleibt; Entfernen Sie das gefilterte ultrareines Wasser in jedem Sammelrohr mit einer Pipette und werfen Sie ab.Hinweis: Versuchen Sie nicht, Restwasser in einem Filterbecher mit einer Pipette zu entfernen, da es den Filter beschädigen kann. Die Filterbecher in ihre Sammelrohre legen.Hinweis: Verwenden Sie die Zentrifugalfiltereinheiten innerhalb einer Stunde, da die Filter beim Trocknen beschädigt werden können. 4. Zellkultur am 2. Tag Die 100-mm-Kulturgerichte aus dem Inkubator herausnehmen.Hinweis: Die empfohlene Zellkulturdauer beträgt 18 Uhr. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus jedem 100 mm Kulturgericht. Fügen Sie jedem Gericht 10 ml Zellkulturmedium hinzu, das die entsprechenden Konzentrationen von Verbindungen oder Medikamenten enthält, wobei darauf geachtet wird, die Zellschicht nicht zu stören.Hinweis: Für Demonstrationszwecke haben wir in diesem Experiment 10 μL 250 mM-Diamid, die in PBS (Endkonzentration von 250 μM) aufgelöst wurden, hinzugefügt. Inkubieren Sie die Kulturgerichte bei 37 ° C für 30 min in Anwesenheit von Diamid oder PBS als Kontrolle. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus jedem 100 mm Kulturgericht. Waschen Sie Zellen, indem Sie sanft 2 ml von 5% Mannitol-Lösung an den Rand jeder Schüssel legen, wobei darauf geachtet wird, die Zellschicht nicht zu stören, und dann die Schale leicht kippen.Hinweis: PBS oder Salzlösung stören sich in die CE-MSS-basierte Metabolomische Analyse und wirken sich negativ auf die Messergebnisse aus und sollten daher nicht als Waschpuffer verwendet werden. Aspirieren Sie den Waschpuffer von jeder Kulturschale, dann waschen Sie die Zellen wieder, indem Sie sanft 10 ml Waschpuffer pro Schüssel hinzufügen und die Schüssel leicht kippen. Den Waschpuffer vom Rand jedes Kulturgerichts völlig absaugen.Hinweis: Aspirieren Sie so viel Wäschepuffer wie möglich, während Sie darauf achten, die Zellen nicht zu saugen. Restmannitol kann die CE-MS-Analyse stören; Das Streben nach Zellen wird die Anzahl der Zellen verringern und so zu einer Quelle von Fehlern bei der Normalisierung der Daten werden. 5. Extraktion von Metaboliten aus kultivierten Zellen Pro Kulturgericht 800 μL von 99,7% Methanol hinzufügen. Jede Kulturschale wird sanft hin-und hergestromt, um ihre gesamte Oberfläche zu bedecken. Lassen Sie das Geschirr bei Zimmertemperatur für 30 s. Fügen Sie langsam 550 μL der verdünnten internen Standardlösung pro Schüssel hinzu, indem Sie die Spitze der Pipette in das Methanol eintauchen und mehrmals sanft nach oben und unten kippen. Jede Kulturschale wird sanft hin-und hergestromt, um ihre gesamte Oberfläche zu bedecken. Lassen Sie das Geschirr bei Zimmertemperatur für 30 s. 6. Ultrafiltration von Zellextrakten Übertragen Sie die extrahierte Lösung von jedem Kulturgericht auf ein separates 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Zentrifuge die Röhren bei 2.300 × g bei 4 ° C für 5 min. Übertragen Sie 350 μL eines jeden Supernatants in zwei Zentrifugalfiltereinheiten pro Probe.Hinweis: Aus jeder Kulturschale werden insgesamt 700 μL der extrahierten Lösung in zwei Filterrohre (350 μL/tube) übertragen. Die Filterrohre bei 9,100 × g bei 4 ° C ca. 2 h zentrifugen, bis keine Flüssigkeit in den Filterbechern bleibt. Die Filterbecher entfernen und die Deckel der Sammelrohre fest verschließen. 7. Probenverdampfung Bereiten Sie einen Zentrifugalverdampfer vor — typischerweise besteht dies aus einem Verdampfer, einer Kaltfalle und einer Vakuumpumpe. Die Sammelrohre in den Zentrifugalverdampfer legen.Achtung: Die Deckel der Rohre offen lassen. Die extrahierten Probenlösungen unter Vakuumbedingungen bei Raumtemperatur verdampfen.Hinweis: Typische Konfigurationen für die Anzahl der Rotationen und des Drucks sind 1.500 U/min bzw. 1.000 Pa, und es dauert in der Regel etwa 3 Stunden, um die Proben vollständig zu verdampfen. Bestätigen Sie, dass keine Flüssigkeit in einem der Sammelrohre verbleibt und schließen Sie die Deckel der Rohre fest. Bewahren Sie die Sammelrohre in einem extrem niedrigen Temperaturbereich (− 80 ° C) bis zur metabolomischen Analyse auf. 8. Metabolomische Analyse von CE-MS Das Filtrat in 50 μL ultrareines Wasser unmittelbar vor der CE-MS-Analyse wiederverwenden. Führen Sie die CE-MS-Analyse mit denbisher beschrieben 12,13mit dem kapillaren Elektrophoresystem und dem Zeitvernahmanag-System Massenspektrometer, das mit einer isokratischen Pumpe, einem CE-MS-Adapter und einem CE-ESI-MS-Sprayer ausgestattet ist.Hinweis: Beide Systeme lassen sich über die Software der Systemhersteller steuern und sind durch eine geschmolzene Siliziumkapillare (50 μm Innendurchmesser × 80 cm Gesamtlänge) verbunden. Instrumente und Probenschwingungen aufstellen, die Kapillare mit einer Kapillarkassette aufbereiten, die Hüllenflüssigkeiten und die entsprechenden Elektrophorese-Puffer je nach Anion-oder Kationenanalysemodus auffüllen und dann Spannungen anwenden.Hinweis: Instrumentierung und analytische Bedingungen werden an anderer Stelle 12,13ausführlich beschrieben. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine Werkliste mit Datenerfassungsmethoden und Musterinformationen. Starten Sie einen Testlauf und überprüfen Sie die Daten wie die Signalintensität und die Spitzenform interner Standards und die Spitzenauflösung anderer Standardverbindungen. Die analytischen Bedingungen gegebenenfalls anpassen. Die Musterlösungen mit 50 mbar für 3 s und einer Spannung von 30 kV injizieren.Hinweis: CE-MS wurde entweder im positiven oder negativen Ionenmodus durchgeführt. Stellen Sie das Spektrometer ein, um den Massenbereich m/50 – 1000 zu scannen. Die Kapillarspannung wurde auf 4 kV eingestellt; Die Durchflussrate des Stickstoffgases (Heizungstemperatur 300°C). Für den positiven Modus wurden die FRFV-Spannung von Fragmentor, Skimmer und OCT auf 75, 50 bzw. 125 V eingestellt. Für den negativen Ionenmodus wurde die FRFV-Spannung des Fragmentors, Skimmer und OCT auf 100, 50 und 200 V festgelegt. Analyse von Spektrumdaten. Extrahalbesitzel aus den Massenspektraldaten mit automatischer Integrationssoftware, um Peak-Informationen wie m/z, Peak-Bereich und Migrationszeit (MT) zu erhalten.Hinweis: Die Methode wird an anderer Stelle 14ausführlichbeschrieben. Ausschließen Sie Signalspitzen, die Isotopomen, Addukt-Ionen und anderen Produktionen bekannter Metaboliten entsprechen. Kommentieren Sie die verbleibenden Spitzen mit Informationen aus der HMT-Metababolitendatenbank nach m/z-Werten und MTs. Normalisieren Sie Bereiche der kommentierten Spitzen auf interne Standardwerte und Zellzahlen pro Probe. Bewerten Sie die Konzentration jedes Metaboliten in den kultivierten Zellen (pmol/10 6Zellen ) mit Standardkurven, die für jeden Metaboliten vorbereitet werden. Nutzen Sie die quantifizierten Stoffwechselkonzentrationen für nachfolgende statistische Analysenund biologische Interpretationen 14.