Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie

1. Cell cultuur op dag 1 Opmerking: elk monster voor metaboliet extractie moet worden bereid uit een enkele 100 mm weefselkweek schaal die is matig maar niet volledig Confluent (met ongeveer 2 tot 5 miljoen cellen). Bereken het aantal gerechten die nodig zijn voor de assay en bereid ze dienovereenkomstig. Cultuur HCC827 en PC-9 cellen in 5% CO2 bij 37 °C in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetale boviene serum (FBS). Aspireren de cel cultuurmedia van de 100 mm cultuur gerechten. Was de cellen op elke schotel met behulp van 2 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), zonder calcium en magnesium. Zachtjes rots elke schotel, zodat de PBS-oplossing volledig dekt het oppervlak van de schotel. Aspireren de Wash buffer van de cultuur gerechten. Warme 0,25% trypsine-EDTA-oplossing voor 37 °C en voeg 2 mL trypsine-EDTA-oplossing toe met een serologische Pipet van 5 mL. Zachtjes rots elke schotel, zodat de trypsine volledig dekt het oppervlak van de schotel. Incubeer de cultuur gerechten bij 37 °C voor ongeveer 5 minuten. Voeg 4 mL van de voorverwarmde volledige groeimedium per schotel toe. De cellen in het midden opnieuw onderbreken door meerdere malen voorzichtig te pipetteren. Breng elke cel schorsing om een aparte 15 mL kegelvormige buis en centrifuge op 800 × g voor 5 min. Opnieuw op te schorten elke cel pellet in 2 mL van de voorverwarmde volledige groeimedium. Bepaal het totale aantal en de percenten levensvatbaarheid van de cellen gebruikend de geautomatiseerde teller van de cel en 0,4% trypaanblauw blauwe oplossing. Meng 10 l van de cel schorsing en 10 l van 0,4% trypaanblauw blauwe oplossing. Laad 10 l steekproef in de cel tellende kamer glijden door middel van capillaire werking. Plaats de kamer Schuif in de automatische teller. Het doorgegeven licht wordt automatisch verlicht en het instrument auto richt zich op de cel. Druk op de Capture knop om het beeld vast te leggen en de resultaten weer te geven. Voeg indien nodig verder groeimedium toe om de gewenste cel concentratie te verkrijgen. Zaad ongeveer 1 tot 2,5 miljoen cellen per 100 mm cel kweek schotel.Opmerking: metaboliet concentraties bepaald door de CE-MS analyse zal worden genormaliseerd op basis van het aantal levensvatbare cellen. Voor het doel van het tellen van cellen, is het noodzakelijk om ten minste een extra gezaaid cultuur gerecht voor elke groep voor te bereiden. Incubeer de kweek gerechten in 5% CO2 bij 37 °c voor 18 uur. 2. bereiding van reagentia Verdun een commerciële interne standaardoplossing met inbegrip van L-methionine sulfon en d-kamfer-10-sulfonic acid 1000-voudige in ultrapuur water.Let op: voor minder dan 80 monsters mengt u eenvoudigweg 50 l van de interne standaardoplossing 1 en 45 mL ultrapuur water in een maatkolf van 50 mL en brengt u de oplossing tot 50 mL met ultrapuur water. Bereid een 0,05 g/mL mannitol oplossing in ultrapuur water als was buffer.Let op: voor minder dan 30 monsters lost u eenvoudigweg 25 g mannitol op in 500 mL ultrapuur water. Ongeveer 15 mL van het wassen buffer is vereist per 100 mm kweekschaal, dus een voldoende volume van de Wash buffer te bereiden op basis van het aantal monsters. 3. pre-wassen centrifugaal filtereenheden Pipetteer 250 l van ultrapuur water in de filterbeker van elke centrifugale filtereenheid (Zie de tabel met materialen).Opmerking: er zijn twee filtereenheden per monster vereist. GLB de filtereenheden stevig en centrifuge bij 9.100 × g bij 4 °c voor 5 min. Controleer het volume van elk filtraat — als significant filtraat is opgebouwd tijdens de eerste korte rotatie, kan de filtereenheid defect zijn. In dat geval verwijdert u de filtereenheid en gebruikt u in plaats daarvan een nieuwe filtereenheid. Sluit de deksels van de filter units stevig af en centrifugeer opnieuw bij 9.100 × g bij 4 °c gedurende 30 min. Zorg ervoor dat geen ultrapuur water in om het even welke filter koppen blijft; Verwijder de gefilterde ultrapuur water in elke collectie buis met een pipet en gooi.Opmerking: Probeer niet om restwater te verwijderen in een filterbeker met een pipet als het kan het filter beschadigen. Vervang de filter cups in hun collectie buizen.Opmerking: gebruik de centrifugale filtereenheden binnen een uur, omdat de filters kunnen beschadigd raken bij het drogen. 4. Cell cultuur op dag 2 Haal de 100 mm kweek gerechten uit de incubator.Nota: de geadviseerde cultuur duur van de cel is 18 h. Aspireren de cel cultuurmedium van elke 100 mm kweek schotel. Voeg 10 mL van de cel cultuurmedium dat de juiste concentraties van verbindingen of drugs omvat aan elk gerecht, waarbij zorg niet verstoren de cel laag.Opmerking: voor demonstratiedoeleinden hebben we in dit experiment 10 l van 250 mM diamide opgelost in PBS (eindconcentratie van 250 μM) toegevoegd. Incubeer de cultuur gerechten bij 37 °C voor 30 min in aanwezigheid van diamide of PBS als controle. Aspireren de cel cultuurmedium van elke 100 mm kweek schotel. Cellen wassen door zachtjes toe te voegen 2 mL van 5% mannitol oplossing aan de rand van elk gerecht, zorg ervoor dat niet te verstoren de cel laag, dan lichtjes kantelen van de schotel.Opmerking: PBS of zoutoplossing interfereert met CE-MS-based metabolomic analyse en nadelige invloed op de meetresultaten, en dus mag niet worden gebruikt als was buffer. Aspireren de Wash buffer van elke cultuur schotel, dan was de cellen weer door zachtjes toe te voegen 10 mL wassen buffer per schotel en iets kantelen van de schotel. Volledig aspireren de Wash buffer van de rand van elke kweek schotel.Nota: aspireren zo veel was buffer mogelijk, terwijl het letten op niet aspireren de cellen. Residuele mannitol kunnen interfereren met de CE-MS analyse; aspiratie van cellen zal het aantal cellen verminderen en zo een bron van fout in gegevens normalisatie worden. 5. extractie van metabolieten uit gekweekte cellen Voeg 800 l van 99,7% methanol per kweek schotel toe. Zachtjes rots elke cultuur schotel heen en weer om het gehele oppervlak te dekken. Laat de gerechten bij kamertemperatuur voor 30 s. Voeg langzaam 550 l van de verdunde interne standaardoplossing per schaal toe door het uiteinde van de pipet in de methanol te dompelen en meerdere keren voorzichtig op en neer te pipetteren. Zachtjes rots elke cultuur schotel heen en weer om het gehele oppervlak te dekken. Laat de gerechten bij kamertemperatuur voor 30 s. 6. filtratie van de cel extracten Breng de geëxtraheerde oplossing van elke kweek schotel over naar een aparte 1,5 mL micro centrifuge Tube. Centrifugeer de tubes bij 2.300 × g bij 4 °c gedurende 5 min. Breng 350 l van elke bovendrijvende over in twee centrifugale filtereenheden per monster.Opmerking: van elke kweekschaal wordt een totaal van 700 l van de geëxtraheerde oplossing in twee filter buizen (350 l/Tube) overgebracht. Centrifugeer de filter buizen bij 9.100 × g bij 4 °c voor ongeveer 2 h tot geen vloeistof in de filter koppen blijft. Verwijder de filter cups en sluit de deksels van de inzamelings buizen stevig af. 7. sample verdamping Bereid een centrifugale verdamper-typisch, dit bestaat uit een verdamper, een koude val, en een vacuümpomp. Plaats de inzamelings buizen in de centrifugale verdamper.Opmerking: laat de deksels van de buizen open. Verdampen de geëxtraheerde monster oplossingen onder vacuümomstandigheden bij kamertemperatuur.Nota: de typische configuraties voor het aantal omwentelingen en de druk zijn 1.500 t/min en 1.000 PA, respectievelijk, en het vergt gewoonlijk ongeveer 3 h om de steekproeven volledig te verdampen. Bevestig dat er geen vloeistof in een van de inzamelings buizen blijft en sluit de deksels van de buizen stevig af. Bewaar de collectie buizen in een ultra-lage temperatuur (− 80 °C) diepvriezer tot metabolomic analyse. 8. Metabolomic analyse door CE-MS Het filtraat in 50 l van ultrapuur water onmiddellijk vóór de analyse van CE-MS opnieuw op te schorten. Voer CE-MS analyse door methoden beschreven eerder12,13 met behulp van capillaire elektroforese systeem en time-of-Flight massaspectrometer systeem uitgerust met een isocratic pomp, een CE-MS adapter, en een CE-ESI-MS sproeier.Opmerking: beide systemen kunnen worden gecontroleerd door de software van het systeemleveranciers en zijn verbonden door een gesmolten silica capillaire (50 μm interne diameter × 80 cm totale lengte). Stel instrumenten en monster flacons, de voorbereiding van de capillaire met een capillaire cassette, vullen schede vloeistoffen en passende elektroforese buffers afhankelijk van anion of kationen analyse modus, en vervolgens van toepassing voltages.Opmerking: instrumentatie en analytische voorwaarden worden in detail beschreven elders12,13. Open de software en bereid een composities met data-acquisitie methoden en sample informatie. Start een test run en controleer de gegevens, zoals de signaalintensiteit en de piek vorm van de interne normen en de piek resolutie van andere standaardverbindingen. Verfijnen indien nodig de analytische condities. Injecteer de sample oplossingen op 50 mbar voor 3 s en een spanning van 30 kV.Opmerking: CE-MS werd uitgevoerd, hetzij in de positieve of negatieve Ion-modus. Stel de spectrometer in om het massa bereik m/z 50 – 1000 te scannen. De capillaire spanning werd vastgesteld op 4 kV; het debiet van stikstof gas (verwarmingstemperatuur 300 °C). Voor de positieve modus, de fragmentatie, skimmer en OCT RFV voltage werden vastgesteld op 75, 50 en 125 V, respectievelijk. Voor de negatieve Ion-modus, de fragmentatie, skimmer, en OCT RFV voltage werd ingesteld op 100, 50, en 200 V, respectievelijk. Analyseer spectrum gegevens. Haal pieken uit de massa spectrale gegevens met behulp van automatische integratie software om piek informatie, waaronder m/z, Peak Area, en de migratietijd (MT) te verkrijgen.Opmerking: de methode wordt in detail elders beschreven14. Sluit signaalpieken uit die overeenkomen met isotopomers, adduct ionen en andere product ionen van bekende metabolieten. Aantekeningen resterende pieken met informatie uit de HMT metaboliet database volgens m/z waarden en MTs. Normaliseren gebieden van de geannoteerde pieken aan interne standaard niveaus en aantallen cellen per monster. Evalueer de concentratie van elke metaboliet in de gekweekte cellen (pmol/106 cellen) met behulp van standaard bochten voorbereid voor elke metaboliet. Gebruik de gekwantificeerde metaboliet concentraties voor latere statistische analyses en biologische interpretaties14.