Оценка клеточный иммунный ответ плодовой мушки Drosophila melanogaster, используя Assay фагоцитоза в естественных условиях
Summary
Этот протокол описывает в естественных условиях фагоцитоза assay в взрослых Drosophila melanogaster для количественного определения фагоцитарной признание и распродажа микробной инфекции.
Abstract
У всех животных врожденного иммунитета обеспечивает немедленное и надежное обороны против широкого спектра патогенных микроорганизмов. Гуморальный и клеточный иммунный ответ являются основными отраслями врожденного иммунитета, и многие факторы, регулирующие эти ответы эволюционно консервируют между беспозвоночных и млекопитающих. Фагоцитоз, центральный компонент клеточной врожденного иммунитета, осуществляется специализированными кровяных клеток иммунной системы. Плодовой мушки Drosophila melanogaster, стала мощным генетических модель для изучения молекулярных механизмов и физиологические последствия фагоцитоза в целом животных. Здесь мы показываем на основе инъекции в естественных условиях фагоцитоза assay для количественного определения поглощения частиц и уничтожения клетками крови дрозофилы , hemocytes. Процедура позволяет исследователям точно контролировать концентрации частиц и дозы, что позволяет получить высокую воспроизводимость результатов в короткий промежуток времени. Эксперимент, количественных, легко выполнить и может быть применен к экран для принимающей факторов, что влияние возбудителя признание, поглощение и распродажа.
Introduction
Врожденной иммунной защиты являются первой линией обороны против болезнетворных микробов. Эти ответы могут быть функционально разделена на гуморальный и клеточный врожденного иммунитета, оба из которых являются опосредовано кодировке микрофлорой шаблон признание рецепторов (ПРРС) которые чувствуют патоген связанные молекулярные структуры (PAMPs)1. В млекопитающих и беспозвоночных, таких как нематода, Caenorhabditis elegans и плодовой мушки Drosophila melanogaster2сохраняются многие из сигнальные пути и механизмы эффекторных врожденного иммунитета. Плодовая муха стала мощной системы для изучения принимающей обороны против инфекционных микроорганизмов3. Дрозофилы генетически шансов справиться с возникающими, легко и недорого, выращенные в лабораториях и имеет время коротких поколения. Кроме того фрукты fly экспонатов высокоэффективных оборону против массив микробов, позволяя рассмотрение принимающих иммунитет против вирусных, бактериальных, грибковых или паразитарные патогенов.
Дрозофилы иммунологов исторически использовали вперед генетических экраны, геном общесистемной РНК опосредованной вмешательства (RNAi) скрининг насекомых клеточных линий и существующие мутант летать штаммов для изучения врожденного иммунитета – приводит к определение и характеристика несколько эволюционно сохранены гуморального иммунного пути4,5,6,,78. Врожденное гуморальный иммунный ответ, вероятно, лучший характеризуется иммунной обороны в плодовых мух. После инфекции гуморальный ответ приводит к производства и системных выпуска антимикробного пептида (AMP) молекул в гемолимфа, крови, эквивалент в насекомых. Усилители производятся высоко сохранены платных и Imd, сигнальные пути. Путь платных гомологичных для млекопитающих рецепторы TLR/Ил 1R сигнализации, и путь Imd гомологичных млекопитающих фактор некроза опухоли альфа сигнализации. В платных дрозофилы, сигнализации индуцируется грамположительных бактерий, грибов и Виру дрозофилы Xs6,9,10 и Imd сигнализации индуцируется грамотрицательных бактерий11 ,12.
Клеточный иммунитет, состоящая из инкапсуляции, melanization и фагоцитоз инвазивных патогенов, осуществляют специализированные клетки крови, называемые hemocytes13. Существует три класса hemocytes в плодовой мухи: кристалл клетки, lamellocytes и plasmatocytes13. Кристалл клетки, которые составляют 5% циркулирующего hemocytes в личинки, выпуск proPhenoloxidase (редложить) ферментов приводит к melanization патогенов и принимающих тканей на участках раны. Lamellocytes, которые обычно не встречаются в здоровых эмбрионов или личинок, являются адэрентных клеток, которые инкапсулируют посторонних предметов. Эти клетки наведены на pupariation или когда паразитирующих осы яйца залегают в личинки. Фагоцитирующих plasmatocytes, которые составляют 95% циркулирующих hemocytes в личинок и все остальные hemocytes в взрослых, играть определенную роль в ткани, Ремоделирование во время разработки и, в частности, служат в качестве основных эффекторных клеток дрозофилы клеточного иммунитета.
Фагоцитоз немедленное и решающее значение линии иммунной защиты; микробы, которые нарушают принимающей эпителиальных барьер быстро охватил и устраняется фагоцитирующих клеток крови (всеобъемлющий обзор клеточной биологии фагоцитоза см. в Справочник 14). Этот процесс инициируется при кодировке микрофлорой распознавание рецепторов (ПРРС) на hemocytes признать возбудителя связанные молекулярные структуры (PAMPs) микробов. Когда-то привязаны к их цели, РРСС инициировать сигнальных каскадов, которые приводят к образованию ложноножки через ремоделирования Цитоскелет актина. Ложноножки окружают Микроб, который впоследствии охватил и включены в зарождающейся органеллы, фагосомы. Микробы уничтожаются как фагосомы проходит процесс созревания фагосомы, когда фагосомы торговли в глубь кровяные и подкисляет через серию взаимодействий с лизосом. In vitro и ячейки биологии исследования в mammalian клетках первичной играют важную роль в идентификации и установлению характеристик факторов, которые регулируют фагоцитоза, например млекопитающих Fc-гамма-рецептор и C3b рецепторов,1516. Тем не менее возможность выполнения крупномасштабных экраны или в естественных условиях исследования ограничены в mammalian системами.
Здесь мы представляем в естественных условиях assay для фагоцитоза в взрослых плодовых мух, которая основана на процедуре, впервые представленный в лаборатории Дэвида Шнайдер в 2000 году17. Шнайдер лаборатории показали, что скальный hemocytes кластерного вдоль брюшной спинной судна легко фагоцитировать шарики полистироля и бактерий. Чтобы визуализировать фагоцитоза, мух вводят с дневно обозначенные частиц (например, кишечной палочки с флуоресцеин Изотиоцианаты (E. coli –FITC)), инкубировали 30 минут позволить hemocytes время, чтобы поглотить частицы, а затем вводится с Трипановый синий, который утоляет флуоресценции частиц не phagocytosed во время инкубационного периода. Затем весь спинной судов отражаются с помощью инвертированного микроскопа флуоресцентные. Этот семенных бумаги, используя сравнительно простой эксперимент, показали, что hemocytes фагоцитоз бактерий и латексные шарики, что бактериальных фагоцитоза могут тормозится предварительно инъекций летит с латексные шарики, и что летает без клеточных и гуморальных иммунные реакции даже подвержен кишечной палочки. Анализа, представленные в настоящем докладе основывается на результатах работы Шнайдер лаборатории для количественного определения в естественных условиях фагоцитоза путем измерения интенсивности флуоресценции частиц, обхватил спинной судно связанного hemocytes.
Подобно подходу, применяемому в mammalian системами, генетики дрозофилы первоначально используется генома всей в vitro RNAi экраны для идентификации генов, необходимых для клеточный иммунный ответ18,19,20 ,21,22,23. Однако развитие взрослых в естественных условиях фагоцитоза assay включен последующих экспериментов, чтобы легко осуществляться в целом животных, таким образом позволяя исследователям для проверки биологического роль факторов, выявленных в исследования in vitro. Так обстояло дело с трансмембранного рецептор Eater, которая была впервые выявлена как бактериальный рецептор RNAi на экране с помощью S2 клетки24 и затем позднее показано посредником Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, и золотистый стафилококк (S. aureus) фагоцитоза в взрослых25.
Наша лаборатория занятых в естественных условиях фагоцитоза assay вперед генетических экранов и генома всей ассоциации исследований (с использованием дрозофилы группа генетических ссылки (DGRP)) для выявления роман гены, которые регулируют фагоцитоза в взрослых hemocytes. Эти исследования привели к характеристике рецепторов PGRP-SC1A и PGRP-са26, внутриклеточный везикул людьми белка Rab1427, глютамат транспортер Полифем28и RNA-связывая протеин Фокс-129.
Мы ожидаем, что будущие экраны, включения в естественных условиях фагоцитоза может привести к выявлению дополнительных генов, которые являются важными для клеточный иммунный ответ у дрозофилы. Экраны с помощью полностью виртуализированных инбредных линий, таких как DGRP или дрозофилы ресурсов синтетических населения (DSPR), можно определить природные варианты влияющие фагоцитоза или кровяные развития. Кроме того техника может быть принят в других видов дрозофила или используется для экрана нового сообщества ресурсы, такие как коллекции 250 видов дрозофилы , поддерживали центр фондовой (NDSSC видов национальной дрозофилы ) в Корнелльском университете. Эти эксперименты может осуществляться с помощью дневно меченых бактериальной или грибковой стенки bioparticles, которые доступны коммерчески или может осуществляться с помощью любое количество бактериальных или грибковых видов-условии, что микроб выражает флуоресцентные маркеры .
Protocol
Representative Results
Discussion
Коммерчески доступных, дневно обозначенные частиц используются для оценки фагоцитоза в целом (0,2 мкм карбоксилат модифицированные микросферы) или фагоцитоза микробов (дневно меченых тепло – или химически убил бактерий или дрожжи). Чтобы оценить фагосомы созревания, исследовате?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доктор Бет Гонсалес и д-р Aprajita Garg за поддержку в проведении экспериментов в естественных условиях фагоцитоза. NSF UMD заранее Грант Seed и UMD NIH T32 учебных грантов, ячейки и молекулярной биологии (CMB) хост-возбудитель взаимодействий (HPI), финансирование этой работы.
Materials
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Génétique. 159 (1), 189-199 (2001).
- De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
- Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
- Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
- Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
- Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
- Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
- Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
- Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
- Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
- Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
- Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
- Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
- Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
- Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
- Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
- Guille, M. . Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , (1999).
- Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Génétique. 167 (1), 203-206 (2004).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
- Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).
