Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce

I cnidariani rappresentano un gruppo eterogeneo di animali che includono meduse, coralli e anemoni di mare. Sono diploblasti, composti da ectodermi ed endodermi separati da una matrice extracellulare (mesoglea). Cnidaria è un gruppo gemello per speciosiare Bilateria, a cui i modelli animali tradizionali come Drosophila e Mus appartengono¹. Inoltre, si pensa che la divergenza di Cnidaria-Bilateria si sia verificata nel periodo pre-Cambriano². Come tale, gli studi comparativi di cnidariani e bilateriani sono essenziali per ottenere informazioni sulla biologia del loro antenato comune più recente. Recentemente, la genomica comparativa ha rivelato che i cnidariani e i bilateriani condividono molti geni del toolkit di sviluppo come tacca e bHLH, il che implica che il loro antenato comune aveva già questi geni³. Tuttavia, il ruolo di questi geni del toolkit di sviluppo nell’ultimo antenato comune di Cnidaria e Bilateria è comparabilmente meno ben compreso. Per affrontare questo problema, è fondamentale studiare come funzionano questi geni profondamente conservati nei cnidariani.

Uno dei modelli genetici cnidariani emergenti è l’antozoo Nematostella vectensis. Il suo genoma è stato sequenziato³, e una varietà di strumenti genetici, tra cui il knockdown genico mediato da morfolino, la transgenesi mediata da meganucle e le knockine e knockout genici mediati da CRISPR-Cas9, sono ora disponibili per l’uso in questo animale. Inoltre, lo sviluppo di Nematostella è relativamente ben compreso. Durante l’embriogenesi, la gastrazione si verifica per invaginazione⁴e l’embrione si sviluppa in una larva di planula che nuota liberamente. La planula successivamente si trasforma in un polipo sessile con bocca e tentacoli circumorali. Il polipo poi cresce e raggiunge la maturità sessuale.

La mutagenesi mirata mediata da CRISPR-Cas9 è ora abitualmente utilizzata per studiare la funzione genica nella vectensis 5 di Nematostella^5,6,7,8,9. Per generare mutanti knockout a Nematostella, un cocktail contenente RNA a guida singola specifici di locus e la proteina Cas9 endonuclease viene iniettato per la prima volta in uova non fecondate o fecondate per produrre animali fondatori F0 che in genere mostrano Mosaicism. Gli animali F0 vengono successivamente allevati alla maturità sessuale e incrociati tra loro per produrre una popolazione di F1, un sottoinsieme dei quali può essere mutanti ad eliminazione diretta⁶. In alternativa, gli animali F0 sessualmente maturi possono essere incrociati con animali di tipo selvatico per generare animali eterozigoti F1, e gli eterozigoti F1 che portano un allele da urlo nel locus di interesse possono quindi essere incrociati tra loro per produrre F2 prole, un quarto di cui dovrebbero essere mutanti ad eliminazione diretta⁵. Entrambi gli approcci richiedono un metodo per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea. I tentacoli polipici possono essere utilizzati per estrarre il DNA genomico per la genotipizzazione^6,7. Tuttavia, nei casi in cui si sta studiando la funzione dello sviluppo del gene di interesse e gli embrioni mutanti non raggiungono lo stadio polipo (cioè a causa della letalità larvale associata alla mutazione), i mutanti knockout devono essere identificati precocemente nell’ontogenesi. Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare singoli animali allo stadio gastrula senza sacrificare l’animale, che consente l’identificazione di mutanti knockout da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni. La durata dell’intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h.