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Biochimie

Isolement des particules de lipoprotéine du jaune d'oeuf de poulet pour l'étude de l'incorporation d'acide gras de pathogène bactérien dans les phospholipides de membrane

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

Cette méthode fournit un cadre pour étudier l’incorporation des acides gras exogènes des sources hôtes complexes dans les membranes bactériennes, en particulier Staphylococcus aureus. Pour ce faire, des protocoles pour l’enrichissement des particules de lipoprotéines du jaune d’oeuf de poulet et le profilage suivant d’acide gras des phospholipides bactériens utilisant la spectrométrie de masse sont décrits.

Abstract

Staphylococcus aureus et d’autres pathogènes Gram-positifs incorporent les acides gras de l’environnement dans les phospholipides membranaires. Pendant l’infection, la majorité des acides gras exogènes sont présents dans les particules de lipoprotéines hôtes. L’incertitude demeure quant aux réservoirs d’acides gras hôtes et aux mécanismes par lesquels les bactéries extraient les acides gras des particules de lipoprotéines. Dans ce travail, nous décrivons des protocoles pour l’enrichissement des particules de lipoprotéine de basse densité (LDL) du jaune d’oeuf de poulet et de déterminer si les LDL servent de réservoirs d’acide gras pour S. aureus. Cette méthode exploite l’analyse lipidomique impartiale et les LDL de poulet, un modèle efficace et économique pour l’exploration des interactions entre les LDL et les bactéries. L’analyse de l’intégration de S. aureus des acides gras exogènes des LDL est effectuée en utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution/précise et la spectrométrie de masse en tandem, permettant la caractérisation de la composition en acides gras de la bactérie membrane et identification impartiale de nouvelles combinaisons d’acides gras qui surgissent dans les lipides de membrane bactérienne lors de l’exposition aux LDL. Ces techniques avancées de spectrométrie de masse offrent une perspective inégalée de l’incorporation d’acides gras en révélant les acides gras exogènes spécifiques incorporés dans les phospholipides. Les méthodes décrites ici sont adaptables à l’étude d’autres agents pathogènes bactériens et de sources alternatives d’acides gras complexes.

Introduction

Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) est la principale cause d’infection associée aux soins de santé et la résistance aux antibiotiques associée est un défi clinique considérable1,2,3. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est une grande priorité. Une stratégie de traitement prometteuse pour les pathogènes Gram-positifs inhibe la synthèse des acides gras, une exigence pour la production de phospholipide membranaire qui, dans S. aureus, comprend le phosphatidylglycérol (PG), lysyl-PG, et la cardiolipine4. Dans les bactéries, la production d’acides gras se produit par l’intermédiaire de la voie de synthèse d’acide gras II (FASII)5, qui est considérablement différente de la contrepartie eucaryotique, faisant FASII une cible attrayante pour le développement d’antibiotiques5,6 . Les inhibiteurs de FASII ciblent principalement FabI, une enzyme requise pour l’allongement de la chaîne de carbone d’acide gras7. Le triclosan inhibiteur FabI est largement utilisé dans les biens de consommation et médicaux8,9. D’autres inhibiteurs FabI sont en cours de développement par plusieurs sociétés pharmaceutiques pour le traitement de l’infection S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Cependant, beaucoup d’agents pathogènes Gram-positifs, y compris S. aureus,sont capables de récupérer les acides gras exogènes pour la synthèse phospholipide, en contournant l’inhibition FASII27,28,29. Ainsi, le potentiel clinique des inhibiteurs FASII est débattu en raison de lacunes considérables dans notre connaissance des sources d’acides gras hôtes et les mécanismes par lesquels les agents pathogènes extraient les acides gras de l’hôte27,28. Pour combler ces lacunes, nous avons développé une méthode d’analyse lipidomique impartiale pour surveiller l’incorporation d’acide gras exogène des particules de lipoprotéines dans les phospholipides membranaires de S. aureus.

Pendant la septicémie, les particules de lipoprotéines hôtes représentent une source potentielle d’acides gras dérivés de l’hôte dans la vascularisation, car la majorité des acides gras hôtes sont associés aux particules30. Les lipoprotéines se composent d’une coquille hydrophile composée de phospholipides et de protéines qui renferment un noyau hydrophobe de triglycérides et d’esters de cholestérol31. Quatre grandes classes de lipoprotéines – chylomicron, lipoprotéines de très faible densité, lipoprotéines de haute densité et lipoprotéines de faible densité (LDL) – sont produites par l’hôte et fonctionnent comme des véhicules de transport lipidiques, livrant des acides gras et du cholestérol à et à partir cellules hôtes par la vascularisation. Les LDL sont abondants en acides gras estérifiés, y compris les triglycérides et les esters de cholestérol31. Nous avons précédemment démontré que les LDL humains fortement purifiés sont une source viable d’acides gras exogènes pour la synthèse de PG, fournissant ainsi un mécanisme pour le contournement d’inhibiteur de FASII32. La purification des LDL humaines peut être techniquement difficile et prendre beaucoup de temps, tandis que les sources commerciales de LDL humains purifiés sont prohibitivement coûteuses à utiliser de façon routinière ou à effectuer des écrans bactériens à grande échelle. Pour remédier à ces limitations, nous avons modifié une procédure d’enrichissement des LDL à partir du jaune d’œuf de poulet, une riche source de particules de lipoprotéines33. Nous avons utilisé avec succès une spectrométrie de masse non ciblée et à haute résolution/précise et une spectrométrie de masse en tandem pour surveiller l’incorporation d’acides gras humains dérivés du LDL dans la membrane de S. aureus32. Contrairement aux méthodes précédemment signalées, cette approche peut quantifier les isoreurs individuels d’acides gras pour chacun des trois principaux types de phospholipides staphylococciques. L’acide oleique (18:1) est un acide gras insaturé présent dans toutes les particules de lipoprotéines hôtes qui est facilement incorporé e dans les phospholipides de S. aureus 29,30,32. S. aureus n’est pas capable de synthèse d’acide oléique29; par conséquent, la quantité d’acide oléique incorporé au phospholipide établit la présence d’acides gras diipoprotéines dans la membrane staphylococcique29. Ces espèces de phospholipides peuvent être identifiées par la méthode de spectrométrie de masse de pointe décrite ici, offrant une résolution sans précédent de la composition membranaire de S. aureus cultivé en présence d’une source d’acides gras qu’il est probable rencontres pendant l’infection.

Protocol

REMARQUE: Le protocole suivant pour l’enrichissement des particules lDL à partir du jaune d’œuf de poulet est dérivé de Moussa et al. 200233. 1. Préparation du jaune d’œuf de poulet pour l’enrichissement des particules de LDL Assainissez deux gros œufs de poulet en lavant les coquilles avec une solution d’éthanol à 70 % et laissez sécher à l’air. Assainiz le séparateur d’œufs à l’aide d’une solution d’éthanol à 70 % et laissez sécher…

Representative Results

Le protocole d’enrichissement du LDL à partir du jaune d’œuf de poulet est illustré à la figure 1. Ce processus commence par la dilution du jaune d’œuf entier avec salin et la séparation des solides jaune d’œuf appelés granules de la fraction soluble ou plasma contenant les LDL (Figure 1)33. La teneur en LDL de la fraction plasmatique est encore enrichie par la précipitation de la 30-40 kDa -livet…

Discussion

S. aureus intègre des acides gras exogènes dans sa membrane phospholipides27,32,43. La synthèse phospholipide utilisant des acides gras exogènes contourne l’inhibition faSII mais modifie également les propriétés biophysiques de la membrane27,32,44. Bien que l’incorporation d’acides gras exogènes dans les phospholipides …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du laboratoire Hammer pour leur évaluation critique du manuscrit et leur soutien à ce travail. Dr Alex Horswill de l’Université du Colorado School of Medicine aimablement fourni AH1263. Le laboratoire du Dr Chris Waters de l’Université d’État du Michigan a fourni des réactifs. Ce travail a été soutenu par l’American Heart Association subvention 16SDG30170026 et les fonds de démarrage fournis par l’Université d’État du Michigan.

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
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References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts – Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

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Citer Cet Article
Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
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