Methoden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje melanogaster

Menselijke activiteiten zijn het vrijgeven van in het milieu een enorme hoeveelheid chemicaliën, die een ernstig probleem voor organismen en voor natuurlijke ecosystemen vertegenwoordigen¹. Van deze verontreinigende stoffen wordt geschat dat ongeveer 1.000 verschillende chemicaliën het normale evenwicht van endocriene systemen kunnen veranderen; Volgens deze eigenschap, worden zij geclassificeerd als endocriene verstorende chemische producten (Edc’s). Specifiek, op basis van een recente definitie van de endocriene samenleving, de Edc’s zijn “een exogene chemische stof, of een mengsel van chemicaliën, die kunnen interfereren met elk aspect van hormoon actie”². In de afgelopen drie decennia zijn er steeds meer wetenschappelijke aanwijzingen dat edc’s de voortplanting en ontwikkeling van dieren en planten^{3,4,5,6,7, 8}. Verder, EDC blootstelling is gerelateerd aan de toenemende prevalentie van sommige ziekten van de mens, met inbegrip van kanker, obesitas, diabetes, schildklier ziekten, en gedragsstoornissen^9,10,11.

Algemene mechanismen van EDC

Door hun moleculaire eigenschappen, edc’s gedragen zich als hormonen of hormoon precursoren^{3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12}. In deze zin kunnen ze binden aan de receptor van een hormoon en verstoren endocriene systemen, hetzij door het nabootsen van hormoon activiteit of door het blokkeren van endogene hormonen bindend. In het eerste geval, na binding aan de receptor, kunnen ze activeren als zijn natuurlijke hormoon zou doen. In het andere geval, binding van het EDC aan de receptor voorkomt dat de binding van zijn natuurlijke hormoon, zodat de receptor is geblokkeerd en kan niet meer worden geactiveerd, zelfs in de aanwezigheid van zijn natuurlijke hormoon³. Als gevolg daarvan kan Edc’s invloed hebben op verschillende processen, zoals de synthese, secretie, transport, metabolisme, of perifere werking van endogene hormonen die verantwoordelijk zijn voor het onderhoud van de homeostase, voortplanting, ontwikkeling, en/of gedrag van het organisme. Receptor binding is niet de enige manier van handelen tot nu toe beschreven voor de Edc’s. Het is nu duidelijk dat zij ook kunnen handelen door het aanwerven van coactivatoren of corepressors in enzymatische wegen of door het wijzigen van epigenetische markers die gen^–uitdrukking¹⁰,^{11,12,13 dereguleren ,14}, met gevolgen niet alleen voor de huidige generatie maar ook voor de gezondheid van generaties om⁸te komen.

Fruitvliegje hormonen

De potentiële effecten van geselecteerde Edc’s zijn op grote schaal bestudeerd, zowel in wilde dierensoorten als in verschillende modelsystemen waarin endocriene mechanismen redelijk bekend zijn. Voor ongewervelden, endocriene systemen die de groei, ontwikkeling en voortplanting beïnvloeden zijn uitvoerig gekenmerkt bij insecten om verschillende redenen, waarbij hun uitgebreide gebruik op het gebied van biologisch onderzoek, hun economisch belang, en Ten slotte is de ontwikkeling van insecticiden in staat om zich specifiek te bemoeien met het hormoon systeem van plagen insecten.

In het bijzonder, onder insecten, heeft de fruitvlieg D. melanogaster bewezen een zeer krachtig modelsysteem te zijn om de potentiële endocriene gevolgen van edc’s te evalueren. In D. melanogaster, evenals in gewervelde dieren, hormonen spelen een belangrijke rol gedurende de hele levenscyclus. In dit organisme, zijn er drie belangrijke hormonale systemen, die de steroïde hormoon 20-hydroxyecdyson (20e)^15,16, de sesquiterpenoid jeugd hormoon (JH)¹⁷te betrekken, en de peptiden en peptide/eiwit hormonen¹⁸. Deze derde groep bestaat uit verschillende peptiden ontdekt meer recentelijk, maar duidelijk betrokken bij een grote verscheidenheid van fysiologische en gedragsmatige processen, zoals levensduur, homeostase, metabolisme, voortplanting, geheugen, en bewegingscontrole. 20E is homoloog aan cholesterol-afgeleide steroïde hormonen zoals estradiol, terwijl JH sommige gelijkenissen met retinol zuur deelt; beiden zijn de beter bekende hormonen in fruitvliegje^19,20. Hun evenwicht is van vitaal belang bij de coördinatie van molting en metamorfose, evenals bij het beheersen van verschillende postdevelopmental processen, zoals voortplanting, levensduur, en gedrag²¹, waardoor het aanbieden van verschillende mogelijkheden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje. Verder, ecdysteroid hormonen en JHs zijn de belangrijkste doelstellingen van de zogenaamde derde generatie insecticiden, ontwikkeld om zich te bemoeien met ontwikkelings-en reproductieve endocriene-gemedieerde processen in insecten. De agonist of antagonist werking van deze chemicaliën is bekend, en dus kunnen ze dienen als referentienormen voor de evaluatie van de effecten van potentiële Edc’s op de groei, voortplanting en ontwikkeling van insecten²². Bijvoorbeeld, Methopreen, die op grote schaal is gebruikt bij de bestrijding van muggen en andere aquatische insecten^23,24, werkt als een JH-agonist en onderdrukt 20e-geïnduceerde gen transcriptie en metamorfose.

In aanvulling op hormonen, de nucleaire receptor (NR) Superfamily in fruitvliegje is ook goed bekend; het bestaat uit 18 evolutionair behouden transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de bestrijding van hormonale-afhankelijke ontwikkelingstrajecten, evenals de voortplanting en fysiologie²⁵. Deze hormoon NRs behoren tot alle zes NR superfamilie subtypen, met inbegrip van die betrokken bij neurotransmissie²⁶, twee voor retinoic zuur NRs, en die voor steroïde NRs die, in gewervelde dieren, één van de primaire doelstellingen van edc’s²⁷vertegenwoordigen.

Fruitvliegje als modelsysteem voor het bestuderen van Edc’s

Op dit moment, op basis van moleculaire eigenschappen, zijn verschillende milieu-agentschappen over de hele wereld toe te schrijven het potentieel om te interfereren met de endocriene systemen om verschillende kunststof-en-klare chemicaliën. Aangezien de Edc’s een mondiaal en alomtegenwoordig probleem zijn voor het milieu en voor organismen, is het algemene doel van het onderzoek op dit gebied het verminderen van hun ziektelast en het beschermen van levende organismen tegen hun schadelijke effecten. Om het inzicht in de mogelijke endocriene effecten van een chemische stof te verdiepen, is het noodzakelijk om het in vivo te testen. Hiertoe vertegenwoordigt D. melanogaster een geldig modelsysteem. Tot op heden, is de fruitvlieg uitgebreid gebruikt zoals in vivo model om de gevolgen van verscheidene milieu Edc’s te evalueren; Er is gemeld dat de blootstelling aan verschillende Edc’s, zoals dibutylftalaat ftalaten (DBP)²⁸, Bisfenol a (BPA), 4-nonylfenol (4-NP), 4-tert-octylfenol (4-tert-op)²⁹, Methylparaben (MP)³⁰, Ethylparaben (EP)^{31, 32}, bis-(2-ethylhexyl) FTALATEN (DEHP)³³, en 17-α-ethinylestradiol (EE2)³⁴, invloeden metabolisme en endocriene functies zoals in gewervelde modellen. Verschillende redenen hebben geleid tot het gebruik ervan als een model op dit gebied van onderzoek. Naast een uitstekende kennis van de endocriene systemen, verdere voordelen zijn de korte levenscyclus, lage kosten, gemakkelijk manipuleerbaar genoom, een lange geschiedenis van het onderzoek, en diverse technische mogelijkheden (Zie de FlyBase website, http://flybase.org/). D. melanogaster biedt ook een krachtig model voor het gemakkelijk bestuderen van transgenerationele effecten en bevolkings reacties op omgevingsfactoren⁸ en vermijdt ethische kwesties die relevant zijn voor in vivo studies bij hogere dieren. Daarnaast is de fruitvlieg aandelen een hoge mate van het behoud van het gen met mensen die het mogelijk maken voor vlieg fruit EDC assays te helpen bij het voorspellen of suggereren potentiële effecten van deze chemicaliën voor de menselijke gezondheid. Naast het vergroten van het begrip over de gevolgen voor de gezondheid van de mens kan fruitvliegje bijdragen aan de beoordeling van Risico’s van EDC-blootstelling aan het milieu, zoals verlies van biodiversiteit en milieudegradatie. Ten slotte, de fruitvlieg biedt het extra voordeel dat wordt gebruikt in laboratoria, waar de factoren die mogelijk van invloed zijn ontwikkeling, voortplanting, en levensduur kan worden gehouden onder controle om elke variatie aan de te testen stof toeschrijven.

Met dit in gedachten, hebben we geoptimaliseerd eenvoudige en robuuste fitness-analyses voor het bepalen van EDC-effecten op sommige fruitvliegje hormonale eigenschappen, zoals Fecundity/vruchtbaarheid, ontwikkelingsstoornissen timing, en volwassen levensduur. Deze tests zijn op grote schaal gebruikt voor een aantal edc’s^{23,24,25,26,27}. In het bijzonder hebben we gebruik gemaakt van de volgende protocollen om de effecten van de blootstelling aan de synthetische oestrogeen EE2³⁴ en BPA en bisfenol af (BPA F) (ongepubliceerde gegevens) te evalueren. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden gewijzigd om de effecten van een bepaald EDC te onderzoeken op een moment, evenals de gecombineerde effecten van meerdere Edc’s in D. melanogaster.