丝状真菌曲霉菌的单步富集蛋白脱乙酰化酶的酶活性测定

1. a. nidulans的栽培 伊诺库鲁姆制剂注: 除孵化外的所有步骤都应在层流柜下执行。 流出 TAP 应变 (例如: TIB32.12) 从甘油库存 (-80°c) 到葡萄糖/木糖最小介质 (gxmm; 每公升: 10.0 克葡萄糖, 0.5 克木糖, 10 毫升 1 m 二铵酒石酸盐溶液, 20 毫升 50 x 盐溶液 [每升: 26.0 gKCl, 26.0 g MgSO4 ·7h2o, 76.0 g kh 2Po4, 1 ml 氯仿], 1 毫升1毫升1毫升 1, 000xhhrner 的微量元素8), 包括 1.5% (w/v) 琼脂和 todd等人所述的所需补充剂, 2007年9。在37°c 下孵化2-3天。注: TIB32.1 包含rpda:: 由 xyloe 诱导启动子 xyl p (p) 10控制的 tap 融合。这就是为什么木糖被包括在上述配方中。当生长的菌株表达不受木质 p(p) 控制的结构时, 忽略木糖。 制备无菌 1.5 mL 离心管, 其中含有 1.5 mL 的无菌综合悬浮液 (CSS; 0.9% (w/v)、0.01% (v/v) 聚山梨酸酯 80)。 湿一次性接种循环在 CSS, 刮掉圆锥1.1.1 从板和悬浮在管从步骤1.1.2。 将每根锥形悬浮液的150Μl 转移到 10 25 厘米2细胞培养瓶, 通风口盖含有 GXMM 琼脂, 包括补充剂和200ΜL 的 css。 使用无菌接种回路将锥形悬浮液分散在烧瓶内, 并在37°c 孵育烧瓶2-3天。 要收获圆锥, 每个烧瓶使用10毫升的 CSS。将溶液倒进烧瓶中, 用提供的螺帽紧紧地合住烧瓶, 大力摇晃烧瓶。 在润湿真菌表面后, 用无菌接种循环完全刮掉剩余的圆锥花序。 通过放置在无菌50毫升离心管上的40μm 细胞过滤器, 并在一个管中收集5个烧瓶的悬浮液。 以 1, 000xg 离心管 10分钟。 在每管10毫升的 CSS 中分解上清液并重新悬浮颗粒。 收集两个悬浮液在一个管, 冲洗空管与40毫升的 CSS, 添加到悬浮液, 和离心机如步骤1.1.9 所述。 在 CSS 的4毫升中分解上清液并重新悬浮锥形颗粒。 准备两个连续的 1:50 稀释的锥形悬浮液, 并确定在产生的 1:2, 500-diluted 稀释悬浮液与计数室的圆锥数的数量, 如所述的第11。 菌丝体的生长和收获 在层流柜下工作时, 接种4-6 个一升锥形烧瓶, 每个烧瓶中含有250毫升的 GXMM, 包括密度为 5×10 6 的适当补充剂 , 并在37°c 时以180转/分的温度孵育14-16h。 将奶酪布放入烧瓶上的漏斗中, 并通过该布过滤菌丝体。用去离子水短暂清洗。 通过挤压被困在奶酪布中的菌丝体, 首先在双手之间, 然后是纸巾, 去除尽可能多的水分。 将干燥的菌丝体作为平板将转移到带螺丝盖的塑料烧杯上, 并用液氮冷冻闪光。这确保了以下冷冻干燥过程的高面积体积比。 在冻干前将冷冻菌丝体存放在-80°c。注: 协议可以在此处暂停。 菌丝体在一夜之间的再冷冻化。 当菌丝体温度保持不变 (18–24小时) 时, 停止冷冻干燥过程。取下烧杯, 并立即用提供的螺帽密封。注: 当紧密密封时, 冻干菌丝体可以在 RT 储存数周。 2. 单步浓缩贴有 tap 标签的 HDAC (改编自 Bayram等人, 2012年)12 缓冲区和解决方案的准备注: 使用前直接在缓冲液中添加 2-硫醇 (EtSH) 和蛋白酶抑制剂。通过0.22μm 硝化纤维素膜过滤用于色谱的所有缓冲液, 以避免在色谱树脂中引入污染物。以下步骤中的说明指的是每个缓冲区的 1 L 的准备。将缓冲区存储在4°C。 萃取缓冲液 (B250): 250 mM 氯化钠, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 (RT), 0.1% (v/v) TX-100, 5 mM etsh。 在800毫升去离子水中溶解12.35 克 Tris-HCl, 2.62 克 Tris (自由碱) 和13.2 克氯化钠, 并加入 10% (v/v) tx-100 溶液的10毫升。 如有必要, 使用 NaOH 或 HCl [5 M] 检查 rt 的 pH 值, 并调整到 pH 值7.5。 通过0.22 微米的硝化纤维素膜制成高达1升并过滤。 在使用前, 直接在每100毫升的缓冲液 (5 mM 最终浓度) 中加入 35μl EtSH。 洗涤缓冲液 250 (WB250): 250 mM Ncl, 40 mM Tris-HCl ph 值 8.0 (RT), tx-100, 5 mM etsh 0.1%。 按照 B250 (2.1.1) 的描述准备 WB250, 但使用3.59 克的 Tris-HCl 和2.08 克的 Tris (免费基地)。 洗涤缓冲液 150 (WB150): 150 mM 氯化钠, 40 mM Tris-HCl ph 值 8.0 (RT), tx-100, 5 mM etsh 0.1%。 按照 B250 (2.1.1) 的描述准备 WB150, 但有3.59 克的 Tris-HCl, 2.08 克的 Tris (免费基地) 和8.77 克的氯化钠。 TEV 平衡缓冲液 (TEB): 150 mM Ncl, 40 mM Tris-HCl ph 值 8.0 (RT), 0.5 mM EDTA, 0.1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH。 与 WB150 相同, 但在 0.5 mM 最终浓度中添加 EDTA。 TEV 裂解缓冲液 (TCB): 150 mM 氯化钠, 40 mM Tris-HCl ph 值 8.0 (RT), 0.5 mM EDTA, 0.1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) 甘油, 5 mM EtSH。 准备与3.59 克的 Tris-HCl, 2.08 克的 Tris (自由碱) 和8.77 克的氯化钠, 并添加100毫升的甘油, 然后调整体积到1升2.1.1。 50x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒: 将市售的蛋白酶抑制剂混合物1片溶解在1毫升的水中, 并储存在-20°c。 TBS-T:50 mM Tris-HCl pH 7.6 (RT), 0.9% (w/v) 氯化碳, 0.1% (v/v) 聚山梨酸酯20。 按照步骤2.1.1 中的说明进行准备。使用6.06 克 Tris-HCl、1.40 克 tris (游离碱)、9克氯化碳和1毫升聚山梨酸盐20。 5XLSB (Laemmli 样品缓冲液): 315 mM Tris-HCl ph 6.8 (RT), 25% (v/v) etsh, 50% (v/v) 甘油, 10% (w/v) SDS, 0.05% (w/v) 溴酚蓝。 蛋白质提取物的制备 在球磨机的磨罐中加入1.5 克冻干菌丝体和磨球。注: 也可以使用新鲜的菌丝体。这样做的时候, 在冷冻前尽可能彻底地干燥菌丝体, 并确保将磨罐用液氮预置, 以研磨新鲜的菌丝体. 将菌丝体磨成25赫兹的粉末, 30s。注: 在没有磨床的情况下, 使用砂浆和磨刀将菌丝体磨成粉末, 如 Bayram等人所述.12岁 将菌丝粉转移到15毫升离心管中。 倾斜离心管, 包括地面菌丝体, 以便随后将菌丝体与缓冲液混合。 加入6毫升冰凉 B250, 包括1xx 蛋白酶抑制剂鸡尾酒每克菌丝体粉, 并与小铲子混合, 直到实现粗提取物的完全均匀化。使用新鲜菌丝体时, 请参阅 Bayram等人.12. 达到正确的生物质提取缓冲比。 将管子放在冰上5分钟。 将试管和平衡管放入离心机中, 在4°c 下以 40, 000xg旋转≥20分钟。在离心过程中对 IgG 树脂进行平衡 (步骤 2.3)。 离心后, 去除10Μl 上清液, 进行 SDS-PAGE 分析。将样品放入含有40μl 的水和125μl 的5XLSB 的 1.5 mL 管中;图 1中称为 “ex”。 使用血清学移液器小心去除上清液 (清除裂解液), 转移到包含平衡 IgG 珠 (2.3 步) 的列上, 并使用所提供的端盖紧紧关闭。 IgG 树脂的平衡 (在步骤2.2.7 中进行) 准备一个10毫升的一次性色谱柱和管道300μl 的良好再悬浮 Igg 树脂 (50% 浆料) 到该柱。用 B250 将柱填充到10毫升, 让缓冲液通过重力流动。 加入1毫升的 B250, 包括1x·蛋白酶抑制剂鸡尾酒, 让流动通过。插入列的底部。 带 tab 标记的 HDAC 的批量纯化 在旋转搅拌机上, 在10°c 时, 在10°c 时, 在旋转搅拌机上, 以2-4小时的速度, 将含有平衡珠子和清除裂解物的色谱柱2.2.9 中清除。 批处理绑定后, 取下盖板, 打开底部的列, 以收集流经。 如步骤2.2.8 所述, 进行 SDS-PAGE 分析的样本;图 1中称为 “ft”。 用10毫升 WB250 清洗珠子。首先, 使用1毫升的缓冲液, 使用移液器从柱盖中取出被困的珠子, 并将该悬浮液在一次冲洗中转移到固定的树脂上, 以允许珠子重新悬浮。然后将柱填充到顶部, 使用堆栈盖关闭, 并连接到蠕动泵。调整流量约为 1-5 mL/min, 防止树脂干燥。 重复步骤2.4.4 三次, 使用 WB250 共洗四次。 如步骤2.4.4 所述, 用10毫升的 TEB 清洗珠子三次。 关闭底部的色谱柱, 在 TCB 的1毫升中重新悬浮 IgG 珠, 并加入50xu 蛋白酶抑制剂鸡尾酒20μl 以及10μl 的 TEV (~ 1 mgml 库存, 内部生产的 S219V 突变体变体). 在4°C 的晚上 10点, 在旋转搅拌机上封盖柱, 并在旋转混合器上孵育, 通过贴有标签的 HDAC 将蛋白质复合物洗脱。注: 或者在高温 (16–25°c) 下进行 TEV 消化, 这减少了反应时间, 但增加了蛋白质降解的风险。 第二天打开柱, 并收集在一个2毫升离心管的洗脱液。使用0.7 毫升的 TCB 从瓶盖上取下珠子, 并冲洗柱壁。 将柱放置在上一步打开的2毫升管上, 该管本身被放置在50毫升的离心管内。 将该组件转移到桌面离心机中, 以 300xg旋转2分钟。这是 TEV 洗脱。注: 执行串联亲和力纯化时, 使用 TEV 洗脱液作为钙调位亲和力步骤的输入。您也可以拆分 TEV 洗脱液, 并使用一个部分进行 HDAC 活性测定, 第二部分用于完成 TAP 纯化。 从 TEV 洗脱液中取出 50μl, 并为 SDS-PAGE 添加12.5μl 的 5XLSB (图1 和 2中称为 “te”), 并将剩余的洗脱液保持在冰上。 为了评估蛋白酶洗脱的效果, 加入2毫升的5% 乙酸, 并在 RT 孵育5分钟。再次, 使用第一个 mL 重新悬浮树脂。 收集酸洗脱液, 再次取50Μl 样品, 加入12.5Μl 的 5XLSB (如图 1所示为 “ae”)。当添加到酸性溶液中时, LSB 会变成黄色。要中和酸, 在1μl 的步骤中加入 10m NaOH, 并充分混合, 直到颜色再次变为蓝色。 用 TBS-T 重新平衡 IgG 树脂, 使其中和酸。将树脂储存在 TBS-T20% (v/v) 乙醇中, 在4°c 下, 与相同的标记蛋白重复使用。 洗脱分数的存储 将洗脱液倾斜到 ~ 100μl 组分中, 以避免多个冻融循环。 将脂肪冻结在液氮中, 并保持在-80°c。注: 以这种方式存储的样品将在几个月内保持稳定, 而不会失去酶活性。 3. SDS-PAGE 和西方印迹的纯化分析 使用标准协议铸造 sds-聚丙烯酰胺凝胶或使用预制凝胶13。在95°c 下, 上一段的变性凝胶样品 5分钟, 离心机在≥15, 000 x g下 5分钟, 并加载到12% 的凝胶上。图 1的图例中给出了建议的加载卷。电泳样品在 1xtris-甘辛 SDS-PAGE 运行缓冲液 180 v 常数60–70分钟, 直到 SDS-PAGE 加载缓冲液的溴酚蓝色标记开始迁移出凝胶。 使用标准协议对凝胶进行银染色。例如, 使用 Blum 等人的协议.1987 14 这也与 ms 分析兼容。 使用标准的西方印迹15。对于下面具有代表性的结果的产生, 使用了一个商业上可获得的印迹系统。 在4°C 的 TBS-T 中, 用市售的抗钙调蛋白结合蛋白 (抗 cbp) 抗体在 TBS-T 中的 5% (w/v) 进行探针印迹。注: 抗 cbp 抗体针对的是在 TEV 裂解后仍然存在的 TAP 标签部分。 使用标准协议检测和开发印迹。例如, 使用抗兔 igg 碱性磷酸酶共轭和 BCIP/NBT 颜色开发基板生成以下具有代表性的结果。 4. 体外 [3h] 醋酸标记鸡网状细胞组蛋白的去乙酰化酶检测 (改编自 Trojer 等人, 2003年)4 有关 [3h] 醋酸标记的鸡网状组蛋白的制备, 请参阅 kölle 等人1998年第16款的协议。 根据检测条件, 将三个 1.5 mL 的离心管放置在冰上, 以便在三重奏中进行测量。也准备三个管只适用于缓冲区的背景控制。 将25μl 的 WB150 放入每个管中, 从步骤2.4.11 添加25Μl 的 TEV 洗脱液, 并保持在冰上。 将管式孵化器预热至25°c。 使用15秒的间隔 (秒表) 在每个管中添加10μl 的标记组蛋白 [1.5 mg/mL]。 在开始检测之前, 取10Μl 的 [3h] 醋酸标记鸡组蛋白, 并开始停止手表。 开始后 5秒, 添加标记的组蛋白, 将管子紧密地关闭, 涡旋, 并将其放入孵化器。 使用15秒的间隔添加10Μl 的标记组蛋白, 然后按照上一步中的说明继续操作。 60分钟孵育后, 每隔15秒在每个管中加入50μl 的停止溶液 (1m Hcl/2 0.4 m 乙酸);涡流立即。添加酸性溶液后, 检测组合是稳定的, 可以保持在 RT, 直到下一步。 在每个试管中加入800μl 乙酸乙酯, 提取释放的 [3h] 乙酸。 紧紧地关闭管, 并旋涡每个管5秒。 将管子放入微型离心机中, 在 rt以10, 000xg 旋转10分钟。 同时, 为每个检测样品准备一个闪烁小瓶, 并为疏水样品添加3毫升闪烁鸡尾酒。 离心后 (步骤 2.12), 小心地将上有机相的600μl 转移到制备的闪烁管中, 并将管紧紧地关闭。 测量液体闪烁计数器中与 HDAC 活性相对应的放射性。