Un modelo de cultivo por lotes In Vitro para estimar los efectos de los regímenes intervencionistas en la microbiota fecal humana
Summary
Este protocolo describe un sistema in vitro de fermentación de cultivo por lotes de microbiota fecal humana, utilizando inulina (un prebiótico bien conocido y uno de los moduladores de microbiota más ampliamente estudiados) para demostrar el uso de este sistema en la estimación de efectos específicos de sobre la composición de la microbiota fecal y las actividades metabólicas.
Abstract
El papel emergente del microbioma intestinal en varias enfermedades humanas exige un avance de nuevas herramientas, técnicas y tecnologías. Estas mejoras son necesarias para descifrar la utilización de moduladores de microbioma para beneficios para la salud humana. Sin embargo, el cribado a gran escala y la optimización de moduladores para validar la modulación del microbioma y predecir los beneficios relacionados con la salud pueden ser prácticamente difíciles debido a la necesidad de un gran número de animales y/o sujetos humanos. Con este fin, los modelos in vitro o ex vivo pueden facilitar el cribado preliminar de moduladores de microbioma. Aquí, se optimiza y se demuestra un sistema de cultivo de microbiota fecal ex vivo que se puede utilizar para examinar los efectos de diversas intervenciones de moduladores de microbioma intestinal incluyendo probióticos, prebióticos y otros ingredientes alimentarios, aparte de nutracéuticos y fármacos, sobre la diversidad y composición de la microbiota intestinal humana. La inulina, uno de los compuestos prebióticos y moduladores de microbioma más ampliamente estudiados, se utiliza como ejemplo aquí para examinar su efecto sobre la composición saludable de la microbiota fecal y sus actividades metabólicas, como el pH fecal y los niveles fecales de ácidos orgánicos incluyendo lactato y ácidos grasos de cadena corta (SCFA). El protocolo puede ser útil para estudios destinados a estimar los efectos de diferentes intervenciones de moduladores en los perfiles de microbiota fecal y a predecir sus impactos en la salud.
Introduction
La microbiota humana es una comunidad compleja que consiste en bacterias, arqueas, virus y microbios eucariotas1,que habitan el cuerpo humano interna y externamente. Las pruebas recientes han establecido el papel fundamental de la microbiota intestinal y el microbioma intestinal (toda la colección de microbios y sus genes que se encuentran en el tracto gastrointestinal humano) en diversas enfermedades humanas, incluyendo obesidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares, y el cáncer1,2,3. Además, los microorganismos que viven en nuestro intestino producen un amplio espectro de metabolitos que afectan significativamente a nuestra salud y también pueden contribuir a la fisiopatología de varias enfermedades, así como una variedad de funciones metabólicas4, 5. Los cambios anormales (perturbaciones) en la composición y función de esta población microbiana intestinal se denominan generalmente “disbiosis intestinal”. La disbiosis generalmente se asocia con un estado incorrecto del huésped y, por lo tanto, se puede diferenciar de la comunidad microbiana normal (homeostática) asociada con un estado de control saludable del huésped. Patrones específicos de disbiosis del microbioma intestinal se encuentran a menudo en varias enfermedades diferentes1,2,3,6,7.
La fermentación de alimentos no digeridos, en particular los carbohidratos/fibras fermentables, por la microbiota intestinal no sólo produce energía, sino que también produce metabolitos divergentes, incluidos los ácidos grasos de cadena corta (SCFAs), lactato, formate, dióxido de carbono, metano, hidrógeno y etanol6. Además, la microbiota intestinal también produce un número de otras sustancias bioactivas como folato, biotina, trimetilamina-N-óxido, serotonina, triptófano, ácido gamma-aminobutírico, dopamina, noradrenalina, acetilcolina, histamina, ácido desoxicólico, y sulfato de 4-etilfenilo. Esto ocurre principalmente a través de la utilización de flujos metabólicos intrínsecos dentro del nicho huésped-microbio, que contribuye en varios procesos corporales, funciones metabólicas y cambios epigenéticos1,8,9, 10. Sin embargo, los efectos de diversas intervenciones en estos productos microbianos siguen sin ser kójeos o poco claros debido a la falta de protocolos fáciles, eficientes y reproducibles. La composición de la microbiota intestinal humana es un ecosistema extremadamente complejo y diverso, y por lo tanto, muchas preguntas sobre su papel en la salud humana y la patología de la enfermedad siguen sin respuesta. Los efectos de muchos moduladores de microbioma intestinal comunes (por ejemplo, probióticos, prebióticos, antibióticos, trasplante fecal e infecciones) en la composición y las funciones metabólicas de la microbiota intestinal siguen siendo en gran medida esquivas. Además, el examen y validación de estos efectos in vivo es difícil, sobre todo porque la mayoría de los nutrientes y metabolitos producidos por la microbiota intestinal se absorben o eliminan simultáneamente y rápidamente en el intestino; por lo tanto, la medición de la producción, la cantidad y la transformación de estos metabolitos (por ejemplo, los sCFA) in vivo sigue siendo un desafío práctico. De hecho, los modelos fisiológicos como los animales y los sujetos humanos son fundamentales para determinar el papel del microbioma intestinal y su modulación en la salud del huésped, pero estos pueden no ser adecuados para el cribado a gran escala de diferentes tipos de moduladores de microbioma debido a limitaciones éticas, monetarias o de tiempo. Con este fin, los modelos in vitro y/o ex vivo, como el cultivo de microbiota intestinal in vitro y luego intervenir con diferentes moduladores de microbiota, pueden ofrecer oportunidades de ahorro de tiempo y dinero y, por lo tanto, pueden permitir un cribado preliminar o a gran escala de diversos componentes (como probióticos, prebióticos, y otros compuestos de intervención) para examinar / predecir sus efectos sobre la diversidad de la microbiota fecal, composición y perfiles metabólicos. Los estudios que utilizan estos sistemas in vitro y ex vivo del microbioma intestinal pueden facilitar una mayor comprensión de las interacciones huésped-microbioma que contribuyen a la salud y la enfermedad del huésped, y también podrían conducir a la búsqueda de nuevas terapias dirigidas al microbioma mejorar la salud del huésped y prevenir y tratar diversas enfermedades1.
Aunque los sistemas in vitro de cultivo de microbiota intestinal no pueden replicar realmente las condiciones intestinales reales, varios laboratorios se han esforzado por desarrollar tales modelos, algunos de los cuales se han encontrado practicables en cierta medida y se han utilizado con éxito para diferentes propósitos. Uno de los modelos intestinales recientes es el Simulador del Ecosistema Microbiano Intestinal Humano, que imita todo el tracto gastrointestinal humano, incluyendo el estómago, intestino delgado, y diferentes regiones del colon. Sin embargo, es posible que otros modelos de investigación de todo el mundo no puedan acceder a estos modelos técnicamente complejos. Por lo tanto, todavía existe una necesidad crítica para el desarrollo de nuevos modelos alternativos que sean relativamente simples, asequibles y prácticos para los laboratorios que estudian los moduladores de microbioma y sus efectos sobre la microbiota intestinal y la salud del huésped. Por lo tanto, el uso de un sistema de cultivo de microbiota fecal in vitro (o ex vivo) sería útil para estudiar los efectos de tales intervenciones11,12. Específicamente, el efecto de diferentes prebióticos en la capacidad de fermentación de la microbiota en términos de cambios periódicos en la diversidad y composición de la microbiota intestinal, el pH fecal, y los niveles de metabolitos microbianos incluyendo SCFAs y lactato pueden ser estudiados 13. En este documento, utilizando la inulina (uno de los componentes prebióticos más estudiados) como ejemplo del modulador de microbioma, se describe un protocolo paso a paso de este sencillo sistema de cultivo por lotes de microbiota ex vivo para demostrar su uso cambios en la microbiota fecal y metabolitos microbianos después de la intervención con los moduladores de microbioma.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de fermentación de purines fecales in vitro presentado aquí es un modelo simple de un solo lote para aproximar los efectos de diferentes sustratos y cepas microbianas (por ejemplo, prebióticos y probióticos) en la composición de la microbiota fecal humana, así como su actividades metabólicas en términos de niveles de pH fecal y SCFAs. Los resultados presentados en este documento demuestran que la inoculación de la inulinación disminuye el pH fecal y aumenta significativamente los niveles de SCFAs y la…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo de fondos del Centro para la Diabetes, la Obesidad y el Metabolismo y el Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales, la Escuela de Medicina Wake Forest, la financiación del Departamento de Defensa (Número de subvención: W81XWH-18-1-0118), la Cátedra Kermit Glenn Phillips II en Medicina Cardiovascular; los Institutos Nacionales de Salud financiados por Claude D. Pepper Older Americans Center (financiado por P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 y el Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales (Unidad de Investigación Clínica, financiado por UL1TR001420), también se reconocen afortunadamente. También agradecemos a los voluntarios por proporcionar muestras fecales, y a nuestros otros miembros del laboratorio por sus ayudas técnicas durante este experimento.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
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