Summary

Bir In vitro Batch-kültür modeli ınsan dışkı microbiota üzerinde girişimsel rejimlerin etkilerini tahmin etmek

Published: July 31, 2019
doi:

Summary

Bu protokol, insan dışkı Mikrobiyota bir in vitro toplu kültür fermantasyon sistemi açıklar, inulin kullanarak (iyi bilinen bir prebiyotik ve en yaygın olarak okudu Mikrobiyota Modulators) belirli etkileri tahmin bu sistemin kullanımını göstermek için dışkı mikrobiota kompozisyon ve metabolik faaliyetler üzerinde müdahaleler.

Abstract

Çeşitli insan hastalıklarında bağırsak mikrobiyomunun gelişmekte olan rolü yeni araçlar, teknikler ve teknolojiler bir atılım gerektirir. Bu tür iyileştirmeler, insan sağlığı faydaları için Mikrobiyom modülatörlerin kullanımını deşifre etmek için gereklidir. Ancak, Mikrobiyom modülasyonunu doğrulamak ve ilgili sağlık avantajlarını tahmin etmek için modülatörlerin büyük ölçekli tarama ve optimizasyonu, çok sayıda hayvan ve/veya insan konularına ihtiyaç nedeniyle pratik olarak zor olabilir. Bu amaçla, in vitro veya ex vivo modeller Mikrobiyom modülatörlerin ön taramasına olanak verebilir. Burada, optimize edilmiş ve probiyotikler, prebiyotik ve diğer gıda maddeleri de dahil olmak üzere gut Mikrobiyom modülatörlerin çeşitli müdahalelerin etkilerini incelemek için kullanılabilecek bir ex vivo dışkı mikrobiota kültür sistemi göstermiştir, kenara Nutraceuticals ve ilaçlar, çeşitlilik ve insan bağırsak mikrobiota bileşimi üzerinde. INULİN, en yaygın olarak çalışan prebiyotik bileşikler ve Mikrobiyom modülatörlerinden biri, burada sağlıklı dışkı mikrobiota kompozisyon ve onun metabolik faaliyetleri üzerinde etkisini incelemek için bir örnek olarak kullanılır, dışkı pH ve organik asitlerin dışkı seviyeleri gibi lakdamak ve kısa zincir yağ asitleri (SCFAs) dahil. Protokol, farklı modülatörlerin dışkı mikrobiota profillerinde ve sağlık etkilerini tahmin etme konusundaki etkilerini tahmin etme amaçlı çalışmalar için yararlı olabilir.

Introduction

İnsan Mikrobiyota bakteri, antik, virüsler ve ökaryotik mikroplardan oluşan kompleks bir topluluktur1, insan vücudunun dahili ve dıştan olması. Son kanıtlar, obezite, diyabet dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarında bağırsak Mikrobiyota ve bağırsak mikrobiyomu (mikropların ve genlerinin tüm koleksiyonu insan gastrointestinal sistem içinde bulunan) temel rolünü kurduk kardiyovasküler hastalıklar, ve kanser1,2,3. Ayrıca, bizim gut yaşayan mikroorganizmalar önemli ölçüde sağlığımızı etkileyen metabolitler geniş bir spektrum üretmek ve ayrıca çeşitli hastalıkların patofizyolojisi yanı sıra çeşitli metabolik fonksiyonlar katkıda bulunabilir4, 5. Bu bağırsak mikrobiyal nüfusun bileşimi ve fonksiyonunda anormal değişiklikler (perturbations) genellikle “gut dysbiosis” olarak adlandırılır. Dysbiosis genellikle ev sahibinin sağlıksız bir devlet ile ilişkilidir ve bu nedenle normal (homeostatik) mikrobiyal topluluktan ev sahibi sağlıklı bir kontrol durumu ile ilişkili ayırt edilebilir. Gut Mikrobiyom dysbiosis spesifik desenler genellikle çeşitli hastalıklarda bulunur1,2,3,6,7.

Sindirilmemiş gıda fermantasyon, özellikle fermente karbonhidratlar/lifler, gut Mikrobiyota tarafından sadece enerji verir değil, aynı zamanda kısa zincir yağ asitleri (scfas), lakdamak, formate, karbondioksit dahil olmak üzere farklı metabolitler üretir metan, hidrojen ve etanol6. Buna ek olarak, gut Mikrobiyota da folat gibi diğer biyoaktif maddelerin bir dizi üretir, biotin, trimethylamine-N-oksit, serotonin, triptofan, gama-aminobutirik asit, dopamin, norepinefrin, asetilkolin, histamin, desoksikolik asit, ve 4-etilfenil sülfat. Bu, öncelikle, çeşitli vücut süreçleri, metabolik fonksiyonlar ve epigenetik değişiklikler1,8,9katkıda ev sahibi mikrobe niş içinde içsel metabolik Cereyanlar kullanımı ile oluşur 10‘ a kadar. Ancak, bu tür mikrobiyal ürünlere yönelik çeşitli müdahalelerin etkileri, kolay, verimli ve tekrarlanabilir protokollerin olmaması nedeniyle belirsizliğini koruyor. İnsan bağırsak mikrobiota kompozisyon son derece karmaşık ve çeşitli ekosistem, ve dolayısıyla, insan sağlığı ve hastalık patolojisinde rolü hakkında birçok soru hala cevapsız kalır. Birçok ortak bağırsak Mikrobiyom modülatörlerinin etkileri (örn., probiyotikler, Prebiyotikler, antibiyotikler, dışkı nakli ve enfeksiyonlar) bağırsak mikrobiota bileşimi ve metabolik fonksiyonları büyük ölçüde zor kalır. Buna ek olarak, muayene ve bu etkilerini doğrulama in vivo zordur, özellikle çünkü bağırsak mikrobiota tarafından üretilen besin ve metabolitlerin çoğu emilir veya aynı anda ve hızlı bir şekilde bağırsakta bertaraf; Bu nedenle, bu metabolitlerin üretim, miktar ve işlenmesi ölçümü (örn., SCFAs) in vivo hala pratik bir zorluk kalır. Nitekim, hayvanlar ve insan konuları gibi fizyolojik modeller, bağırsak mikrobiyomunun rolünü belirlemek ve ana sağlık üzerindeki modülasyonu için kritik öneme sahiptir, ancak bu durum nedeniyle farklı Mikrobiyom modülatörlerinin büyük ölçekli taramaları için uygun olmayabilir. Etik, parasal veya zaman kısıtlamaları. Bu amaçla, in vitro ve/veya ex vivo modelleri, gut Mikrobiyota in vitro kültürü gibi ve daha sonra farklı Mikrobiyota modülatörler ile müdahale, zaman sunabilir ve para tasarrufu fırsatları ve dolayısıyla ön veya büyük ölçekli tarama için izin verebilir çeşitli bileşenler (probiyotikler gibi, Prebiyotikler, ve diğer girişimsel bileşikler) incelemek/dışkı mikrobiota çeşitlilik üzerindeki etkilerini tahmin, kompozisyon ve metabolik profiller. Gut mikrobiyomunun böyle in vitro ve ex vivo sistemlerini kullanan çalışmalar, ana sağlık ve hastalığa katkıda bulunan ana bilgisayar-Mikrobiyom etkileşimlerinin daha fazla anlayışını kolaylaştırabilir ve aynı zamanda mikrobiyomu hedefleyen yeni tedaviler bulmaya yol açabilir Ana sağlık iyileştirmek ve önlemek ve çeşitli hastalıklar tedavi1.

İn vitro gut Mikrobiyota kültür sistemleri gerçekten gerçek bağırsak koşullarını çoğaltmak olmasa da, birkaç laboratuar bazı ölçüde uygulanabilir bulundu ve başarıyla kullanılan bu tür modeller geliştirmek için çaba var farklı amaçlar. Son bağırsak modellerinden biri, mide, ince bağırsak ve kolon farklı bölgeleri de dahil olmak üzere tüm insan gastrointestinal sistemi taklit eden ınsan bağırsak mikrobiyal ekosisteminin simülatörüdür. Ancak, bu tür teknik karmaşık modeller dünya çapında diğer araştırma tesisleri için erişilebilir olmayabilir. Bu nedenle, Mikrobiyom modülatörleri ve bağırsak Mikrobiyota ve ana sağlık üzerindeki etkilerini okuyan laboratuvarlar için nispeten basit, uygun fiyatlı ve pratik yeni alternatif modellerin geliştirilmesi için kritik bir ihtiyaç hala vardır. Bu nedenle, bir in vitro kullanımı (veya ex vivo) dışkı Mikrobiyota kültür sistemi bu tür müdahalelerin etkilerini incelemek için yararlı olacaktır11,12. Özellikle, bağırsak mikrobiota çeşitlilik ve kompozisyon periyodik değişiklikler açısından mikrobiota fermantasyon kapasitesi üzerinde farklı prebiyotikler etkisi, dışkı pH ve SCFAs ve lakdamak dahil mikrobiyal metabolitlerin seviyeleri incelenebilir 13. burada, Mikrobiyom Modülatörün bir örneği olarak inulin (en yaygın olarak çalışılan prebiyotik bileşenlerden biri) kullanarak, bu basit ex vivo Mikrobiyota toplu kültür sisteminin bir adım-adım protokolü, tahmin etmek için kullanımını göstermek için açıklanmıştır Mikrobiyom modülatörleri ile müdahale aşağıdaki dışkı Mikrobiyota ve mikrobiyal metabolitleri değişiklikler.

Protocol

DIKKAT: uygun malzeme güvenliği veri sayfalarına başvurun ve uygun Biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) eğitimiyle ilgili talimatları ve yönergeleri izleyin. Standart Biyogüvenlik kurallarına göre tüm kültür adımlarını izleyin ve aseptik koşulları kullanarak bir BSL-2 kabine kullanın. Dahası, farklı modellerden ve insan konularından gelen dışkı numuneleri mikrobiyal kaynaklı hastalıkların yayılması riski olabilir. Hemen herhangi bir yaralanma ve enfeksiyon oluşumunda tıbbi yardım isteyin. Bun…

Representative Results

Protokol belirli bir prebiyotik etkisini göstermek için kullanılır (yani, Mikrobiyota bileşimi ve metabolik faaliyetler üzerinde inulin dışkı pH değişiklikleri açısından ve lakdamak ve SCFAs konsantrasyonu sağlıklı insan konularının dışkı içinde İnulin ile tedavi aşağıdaki farklı zaman noktaları). Dışkı pH ‘sı, lakdamak ve scfas ‘ın dışkı seviyeleri (Şekil 1) ve Mikrobiyota bileşimi (Şekil 2</strong…

Discussion

Burada sunulan in vitro dışkı Bulamaç fermantasyon modeli, farklı substratlar ve mikrobiyal suşları (örn. prebiyotik ve probiyotikler) etkileri yaklaşık olarak insan dışkı mikrobiota bileşimi üzerinde basit bir tek toplu model yanı sıra onun dışkı pH ve SCFAs seviyeleri açısından metabolik faaliyetler. Burada sunulan sonuçlar iniyanenin inokülasyon dışkı pH azaltır ve önemli ölçüde INULİN-tedavi dışkı mikrobiota kültürü ile karşılaştırıldığında iç-tedavisi dışkı numuned…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar minnetle diyabet, obezite ve metabolizma ve klinik ve translasyonel Bilim Merkezi, uyandırma orman Okulu tıp, Bölüm Savunma Fonu (Grant numarası: W81XWH-18-1-0118) için merkezi ‘nden fon desteği kabul Kardiyovasküler tıp Kermit Glenn Phillips II koltuğu; Ulusal Sağlık Enstitüleri Claude D. Pepper eski Amerikalılar Merkezi (P30AG12232 tarafından finanse) finanse; R01AG18915; R01DK114224 ve klinik ve translasyonel Bilim Merkezi (klinik araştırma birimi, UL1TR001420 tarafından finanse edilen), aynı zamanda minnetle kabul edilir. Biz de dışkı örnekleri sağlamak için gönüllülere teşekkür ederiz, ve teknik için diğer laboratuar üyeleri bu deney sırasında yardımcı olur.

Materials

Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich 217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGI C2388 Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) Sigma-Aldrich 255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) Acros organics 2063450000 Toxic, Irritating
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C121800
D-biotin Sigma-Aldrich B4501
D-Pantothenic acid Alfa Aesar A16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) Biorad 1610729
DL-α-methylbutyrate Sigma-Aldrich W271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) Sigma-Aldrich F8263 Toxic
Folic acid Alfa Aesar J62937
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Hemin Sigma-Aldrich H9039
Hepes Alfa Aesar A14777
Isobutyrate Alfa Aesar L04038
Isovalerate Alfa Aesar A18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) Sigma-Aldrich M8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) Sigma-Aldrich 221279
Niacin (Nicotinic acid) Sigma-Aldrich N4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) Alfa Aesar A14366 Toxic
N-valerate Sigma-Aldrich 240370
P-aminobenzoic acid MP China 102569 Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4) Sigma-Aldrich P5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) Sigma-Aldrich 1551128
Pyridoxine Alfa Aesar A12041
Resazurin Sigma-Aldrich R7017
Riboflavin Alfa Aesar A11764
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich 1613757
Sodium chloride (NaCl) Fisher BioReagents 7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Chemicals S320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) Acros organics 206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) Acros organics 148991000
Trypticase BD Biosciences 211921
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) Sigma-Aldrich Z0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beads Agencourt
Anaerobic chamber with incubatore Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filter Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencer Miseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kit Qiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeter InVitrogen
Vortex Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system Waters Corporation

References

  1. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  2. Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
  3. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  4. Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
  5. Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
  6. Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
  7. Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
  8. Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
  9. O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
  10. Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
  11. Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
  12. Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
  13. Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
  14. Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
  15. Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
  16. Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
  17. Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
  18. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  19. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  20. Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
  21. Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
  22. Chen, M. -. H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
  23. Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
  24. Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
  25. Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).
  26. Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).

Play Video

Citer Cet Article
Ahmadi, S., Wang, S., Nagpal, R., Mainali, R., Soleimanian-Zad, S., Kitzman, D., Yadav, H. An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota. J. Vis. Exp. (149), e59524, doi:10.3791/59524 (2019).

View Video