CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme
Summary
Burada sunulan verimli CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein aracılı gen düzenleme meme hücrelerinde tüp Elektroporasyon kullanarak bir protokoldür.
Abstract
CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) tarafından temsil edilen gen düzenleme nükller, biyomedikal araştırmalarda ana araçlar haline gelmektedir. CRISPR/Cas9 öğelerinin transfeksiyon yoluyla hedef hücrelere başarılı bir şekilde teslimi, verimli gen düzenleme için bir önkoşuldur. Bu protokol, tüp Elektroporasyon (te) makine aracılık teslim Crispr/Cas9 ribonukleoprotein (RNP), tek-telli oligodeoxynucleotide (ssodn) bağışçı şablonları mammalin hücrelerin farklı türleri ile birlikte gösterir, sağlam yol açar kesin gen düzenleme olayları. İlk olarak, te, tavşan fibroblast hücrelerinde interlöşin 2 reseptör altbirim Gama (IL2RG) geni ve Sepiapterin Redüktaz (SPR) geni içinde hastalığa neden olan mutasyonları teşvik etmek için Crispr/Cas9 RNP ve ssodns sunmak için uygulandı. % 3.57%-20 ‘ si hassas mutasyon oranları, bakteriyel TA klonlama sıralaması ile belirlendiği şekilde elde edilmiştir. Aynı strateji daha sonra insan iPhone ‘larda epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), miyosin bağlayıcı protein C, kardiyak (MYBPC3 genlerindeki mutasyonlar) ve hemoglobin altbirim Beta (HBB) dahil olmak üzere çeşitli klinik olarak ilgili genler üzerinde kullanılmıştır. Sürekli olarak, son derece hassas mutasyon oranları elde edildi (11.65%-37,92%) derin sıralamanın (DeepSeq) belirlediği şekilde. Bu çalışma, CRISPR/Cas9 RNP ‘nin tüp electroporasyonu, memelinin hücrelerinde gen düzenlemesi için verimli bir transfeksiyon protokolünü temsil ettiğini göstermektedir.
Introduction
CRISPR/Cas9 gen düzenleme için en sık kullanılan programlanabilir çekirdektir. Tek Kılavuzlu RNA (sgRNA) ile çalışır-hem hedef sıralarının hem de genomdaki bitişik protospacer bitişik motif (PAM) dizisinin aracılı tanınması. Cas9 nükleaz, Pam dizisi1‘ in upstream üç nükleotid bulunan bir çift telli DNA Break (DSB) oluşturur. DSN ‘Ler, hataya eğilimli olmayan Homologous uç birleştirme (NHEJ) veya Homoloji yönlendirilmiş onarım (HDR) yolları aracılığıyla onarılır. HDR yolu ile kesin gen düzenleme elde etmek için, donör şablonları genellikle plazmid DNA (pDNA) veya tek telli oligodeoxynucleotide (ssODN) biçiminde sağlanır.
Crispr/Cas9 ve sgrna üç formatta hücrelere teslim edilebilir: Cas9 protein ve Grna ribonukleoprotein (RNP) kompleksi2,3; Cas9 mRNA ve sgrna4,5; veya Plasmid DNA (pdna) gerekli Promoters içerir, Driven sgrna, ve Cas9 kodlama bölgesi6,7,8. Birçok grup, CRISPR/Cas9 RNP olarak teslim edildiğinde, gen düzenleme verimliliği genellikle pDNA veya mRNA formatlarında elde ettikleri, nüklik asitler9ile karşılaştırıldığında çok daha küçük RNP boyutuna atşabilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca, daha önce bir roman tüp Elektroporasyon (te) makine özellikle birkaç hücre türleri gen düzenleme uygulamalarında etkili olduğunu gösterilmiştir9.
Mevcut çalışma sunulan bir adım-adım protokol çeşitli klinik olarak ilgili loci farklı türlerin memeliler hücrelere CRISPR/Cas9 RNP teslimi için TE kullanarak. Bu roman TE transfeksiyon tekniği ve yüksek HDR oranı fenomen Biyomedikal araştırma geniş uygulamalar bulabilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüp Elektroporasyon yöntemi tavşan ve insan hücrelerine Crispr/Cas9 RNP ve ssodns teslim etkili oldu, sağlam hassas gen düzenleme (PGE) önde gelen. TE ve diğer konvansiyonel Elektroporasyon cihazları arasındaki birincil fark, iki elektrotların tüpün üst ve alt kısmında olduğu bir tüpün kullanımı ve örnek, Elektroporasyon üzerine mühürlenmiş olarak tam olarak yüklenir (Şekil 1). Buna karşılık, geleneksel bir küvette, elektrotlar yanlarda ve numune Elektroporasyon sırasında tamamen mühürlenmez. Bu yeni tasarım, hava balonu üretimini azaltır ve hava balonu boyutunu sıkıştırır ve dolayısıyla elektrik voltajının bile dağılımını geliştirir ve sonuç olarak düşük hücre ölümü ve yüksek transfeksiyon verimliliği9‘ a yol açar. Mevcut çalışma, yüksek PGE oranları (% 15-37%) insan iPSCs ‘de EGFR, Mybpc3 genlerindeki mutasyonlar ve HBB genlerini hedeflemede elde edildi. Bu sonuçlar, insan kök hücrelerinde yüksek PGE oranlarının elde edildiği önceki bir rapor ile tutarlı9.
Hastalık neden mutasyonlar tavşan hücrelerinde IL2RG ve SPR genleri hedeflenmiştir. Son zamanlarda, IL2RG-Knockout tavşan insan X bağlantılı şiddetli kombine immünyetmezlik (scid-x1)16,17için modeller olarak üretilmektedir. Mevcut çalışma, hasta IL2RG mutasyonları (örn., C231Y ve Q235X) tavşan hücrelerinde verimli bir şekilde oluşturulabilir ve hasta mutasyonları taşıyan SCID-x1 tavşan modelleri yaratmanın fizibilitesini göstermektedir. Ayrıca SPR R150G mutasyonların tavşan hücrelerinde verimli bir şekilde oluşturulduğunu göstermiştir. Bu mutasyon12çocuklarda motor ve bilişsel açıkları neden olur. Bu IL2RG ve SPR mutasyon tavşan modelleri, bir kez oluşturulan, translasyonel çalışmalar için değerli preklinik modeller olarak hizmet verebilir. Onlar da bu monojenik hastalıklar için gen düzenleme tabanlı terapi kurmak için kullanılabilir.
CRISPR/Cas9-aracılı gen düzenleme uygulamaları için bir endişe off-Target düzenleme olaylardır. INDEL oranları, bu çalışmada (tablo S1) kullanılan sgRNAs için önceden öngörülen üst off-Target sitelerinde, daha önce9‘ da açıklanan yöntemleri kullanarak incelenmiştir. Toplam olarak, yedi potansiyel üst off-Target loci SG-RB-IL2RG-01, beş SG-RB-spr için, yedi SG-hegfr için, beş SG-hMybpc3 ve yedi SG-hhbb için), tablo S2listelenen astarlar kullanarak incelendi. Bu sgrnas ‘ı kullanarak Crispr/Cas9 aracılı gen düzenleme için en az hedef dışı riskleri gösteren T7E1 deneyleri (Şekil S1) tarafından hiçbir hedef dışındaki ındels ortaya çıkarıldı. Ayrıca, tüp Elektroporasyon yönteminin kendisini hedef olmayan düzenlemeleri neden veya artırmadığını da gösterir. Yine de, çabaları azaltmak veya istenmeyen hedef dışı düzenlemeleri ortadan kaldırmak için adanmış olmalıdır. Tüm genom sıralaması, klinik uygulamalarda kullanılmak üzere tasarlanan hücreler için bu tür olayları dışlamak için gerekli olabilir.
Teknik düzeyde, aşağıdaki CRISPR/Cas9 RNP tüp Electroporation tarafından verimli hassas genom düzenleme elde etmek için önemli faktörler olarak kabul edilir. İlk olarak, öngörülen düşük hedef potansiyele sahip verimli bir sgRNA seçmeniz tavsiye edilir. Peg uygulamaları için kullanmadan önce seçilen sgrna ‘nın INDEL verimliliğini doğrulamak önemlidir. Bir yazılım iyi sgRNA doğrulama adımda başarısız tahmin nadir değildir.
İkinci olarak, yüksek PGE elde etmek için, mümkün olduğunda ssODN donör bir PAM mutasyonu teşvik etmek için tavsiye edilir. Mantık bu şekilde yaparak, CRISPR/Cas9 yeniden kesme donör şablon entegrasyonu engellenir sonra. Bazı durumlarda, PGE ‘nin kendisi PAM mutasyonları tanıtır. Diğer durumlarda, PAM sırasına Sessiz mutasyonlar tanıtmak mümkündür. Bir PAM mutasyonu mümkün olmadığından, sgRNA serisine karşılık gelen donörde birkaç sessiz mutasyon dahil etmeye çalışmaları tavsiye edilir.
Üçüncüsü, özellikle te ile alakalı, hücre ve RNP karışımı Elektroporasyon tüpüne aktarırken hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek önemlidir. Bir TE tüp tasarımı zaten hava kabarcık oluşumu en aza indirirken, dikkatli kullanım daha da azaltır ve hatta hava kabarcık oluşumu önlemek tamamlamak olabilir. Crispr/Cas9 ribonukleoprotein aracılı hassas gen düzenleme için tüp Elektroporasyon uygulamada karşılaşılabilir sık sorunlar için bir sorun çekim Kılavuzu Tablo 2sağlanır.
Sonuç olarak, burada tüp Elektroporasyon yüksek PGE oranları elde etmek için memeli hücrelere CRISPR/Cas9 RNP ve ssODNs teslimi için etkili bir araç olduğunu gösterilmiştir. Bu yeni TE transfeksiyon tekniği ve sağlam hassas gen düzenleme oranı, gen düzenleme uygulamalarının gelişimini kolaylaştırabilir.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21OD023194-JX) tarafından destekleniyordu. Bu çalışma, Michigan Tıp Merkezi Üniversitesi ‘nde translasyonel Bilimler ve Therapeutics (CAMTraST) için gelişmiş modeller Merkezi tarafından desteklenen çekirdek hizmetler kullanılmıştır.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
| Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
| DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
| Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
| Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
| Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
| Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
| mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
| PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
| Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
| Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
| Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
| Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
| Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
| Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
| Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Miller, J. B., et al. Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).
- Finn, J. D., et al. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Liang, C., et al. Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma. Biomaterials. 147, 68-85 (2017).
- Luo, Y. L., et al. Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles. ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).
- Wang, H. X., et al. Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).
- Xu, X., et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).
- Du, F., et al. Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).
- Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M., Adam, M. P., et al. . GeneReviews(R). , (1993).
- Friedman, J., et al., Adam, M. P., et al. . GeneReviews(R). , (1993).
- Hidaka, N., et al. Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).
- Ma, H., et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Song, J., et al. Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency. Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).
- Song, J., et al. Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting. Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).
