Insan kaynaklı pluripotent kök hücresini kullanma- Salmonella ve diğer patojenlere karşı epitelyal hücre korumasını Incelemek ve değiştirmek Için bağırsak organoidleri türetilmiştir

1. kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin kültür ve paslanmaya Not: Burada açıklanan tüm yöntemler, ticari olarak kullanılabilen insan hücresi çizgilerini kullanır. Aşağıda ayrıntılı tüm doku kültürü çalışmaları bir sınıf II laminar akış kaputu yapılmalıdır. ıpscs rutin olarak kök hücre kültürü ortamında tutulur ( malzeme tablosunabakın), üreticinin talimatlarına göre, bir hafta sonu ücretsiz ıpscs kültürü sağlar. ıpscs göreli kolaylığı ile diğer IPSC kültür sistemlerinden uyarlanabilir. Koloniler plaka yüzeyinin yaklaşık% 80-90 ‘ ını kapladıktan sonra hücreleri geçiş. Geçiş için plakaları hazırlayın 1 saat kullanmadan önce, Dulbecco ‘nun fosfat-tamponlu tuzlu (DPBS; kalsiyum olmadan [CA] veya magnezyum [mg]) doku-kültür-tedavi plakalarına kadar seyreltilmiş vitronektin 10 μg/mL eklenerek. Kaplama birimleri plaka boyutuna bağlıdır ve üreticinin talimatında bulunabilir. Bu süre zarfında, sıcak kök hücre kültürü Orta oda sıcaklığında (RT). Medya ıpscs geçiş için hazır çıkarın ve hücreleri 2x DPBS (CA veya mg olmadan) yıkayın. Tabaklar için EDTA solüsyonu ( malzeme tablosunabakın) ekleyin, tüm yüzeyin kaplı olduğundan emin olun ve RT ‘de 5 – 8 dakika boyunca inküye yapın. Delik IPSC kolonilerinin merkezinde görünmeye başlar, Aspire ve EDTA solüsyonu atın. Kuyulara kök hücre kültürü ortamı ekleyin; birkaç kez plaka yüzeyi üzerinde yavaşça yıkama medya tarafından ıpscs çıkarın. Ipscs tek hücreler olarak değil, küme olarak geçmeli, bu nedenle EDTA çözümünün çok uzun süre kalmadı olduğundan emin olun. Herhangi bir iPSCs ‘yi 15 mL Konik Tüpe taşıyın. Vitronektin ön kaplı plakalardan aspirate ve kök hücre kültürü ortamı ile değiştirin. IPSC süspansiyonu, iPSCs ‘nin konik tüpün altına yerleşmez olduğundan emin olmak için bir kaç kez invert edin ve yeni bir plakaya 1:10 seyreltme sağlamak için uygun süspansiyon hacmini ekleyin. Bölünmüş oranlar, IPSC hatları arasında farklılık gösterebilir IPSC büyüme hızına bağlı olarak ayarlanabilir. Ipscs ‘yi yüzeye dağıtmak ve 37 °C/5% CO2’ de bir kuluçl içine yerleştirmek için plakayı kaya. İPSCs ‘yi paslanma sonrası gün besleyin. 2. iPSCs ‘den hindgut ‘a farklılaşma 0. günde, ıpscs ‘yi 10 cm ‘lik doku-kültürü-tedavi edilen bir çanak üzerine bölüştür, adım 1,2 ‘ de açıklandığı gibi vitronektin ile ön kaplı, 10 ml kök hücre kültürü ortamına aktivin a (10 ng/ml) + temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF; 12 ng/ml) ile tamamlayıcı olarak eklenmiştir. Kullanım önce doğrudan ortama büyüme faktörleri ekleyin; tüm sonraki adımlarda bunu. 1. günde, medyayı değiştirin (10 ml kök hücre kültürü ortamı aktivin A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]). Gün 2, aşağıdaki büyüme faktörleri ile tamamlayıcı kök hücre kültürü orta 10 ml medya değiştirerek farklılaşma başlayın: aktivin A (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), kemik morfogenetik protein 4 (BMP-4; 10 ng/ml), fosfoinositol 3- kinaz inhibitörü LY294002 (10 μM) ve GSK3 inhibitörü CHIR99021 (3 μM). 3. gün, medya değiştirmek 10 ml kök hücre kültürü ortam aktivin A ile tamamlayıcı (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml), ve LY294002 (10 μM). Bu medya tarafından indüklenen endoderm belirtimi sonraki 24 saat içinde IPSC kolonisi morfoloji görünür değişikliklere neden olmalıdır. 4. gün, 10 ml rpmi/B27 medya (100 ng/ml) ve bFGF (100 ng/ml) aktivin ile tamamlayıcı medya değiştirin.Not: Rpmi/B27 medya içerir 500 ml RPMI orta ile L-glutamin takviyesi (bakınız Tablo 1), 10 ml B27 ek (50x, serum ücretsiz), ve 5 ml gereksiz amino asitler. Opsiyonel: 5 mL penisilin-streptomisin (10.000 U/mL) ekleyin. Kullanmadan önce filtre sterilize edin. 5. gün, 10 ml rpmi/B-27 medya için ortam değiştirmek aktivin A (50 ng/ml) ile desteklenmektedir. Gün 6, hindgut posterior endoderm desenle başlamak IÇIN, CHIR99021 (6 μm) + retinoik asit (3 μm) ile tamamlayıcı rpmi/B27 medya 10 ml medya değiştirin. Gün 7, 8ve 9, adım 2,7 yineleyin. Bu adımlar sırasında, hindgut görünür 3-b yapıları belirgin hale, plaka yüzeyini kaplayan olmalıdır. 10. gün, ortaya çıkan hindgut Bodrum membran matris embed ( malzeme tablosunabakın). 3. Bodrum membran matrisinde hindgut gömme IHO baz büyüme medya makyaj (500 mL gelişmiş Dulbecco ‘s modifiye kartal orta [DMEM]/F12, 10 mL B27 takviyesi [50x, serum ücretsiz], 5 ml N2 Supplement [100x, serum serbest], 5 mL 1 M 4-(2-hidroksiil) -1-piperazineethanesulfonik asit (HEPES) ve 5 mL esansiyel olmayan amino asitler [100x]. Opsiyonel: 5 mL penisilin-streptomisin ekleyin [10.000 U/mL]; kullanmadan önce filtre sterilize edin. Bkz. Tablo 1). Hindgut plakadan medyayı çıkarın ve plaka 1x ile DPBS (CA veya mg olmadan) yıkayın. Plakaya 5 ml kolajenaz solüsyonu ekleyin ve 37 °c ‘ de 5 dakika boyunca inküye yapın. Ekleyerek kolajenaz solüsyonu üretmek 500 ileri dmem/F12 400 ml kolajenaz IV toz mg. Bunun ardından, 100 mL serum değiştirme ( malzeme tablosunabakın), 5 ml L-glutamin (200 mm) ve 3,5 μL 2-mercaptoetanol ekleyin ve karışımı için çözüm girdap. Filtreleme-kolajenaz tozu tamamen çözündüğünde solüsyonu sterilize edin.Not: Bu, daha küçük aliquots 6 ay kadar-20 °C ‘ de depolanabilir. Plakaya 5 ml İHO baz büyüme ortamını ekleyerek kolajenaz ‘yi inaktive ederek, bir hücre kazıyıcısı kullanarak hindgut hücrelerinden uzaklaştırın ve 15 ml konik tüpte hindgut süspansiyonu toplayın. 240 x g ‘de santrifüjün 1 dakika ve pipet kapalı supernatant. 10 mL medya ekleyin, yavaşça pipetleme ile küçük parçalar halinde hindgut kırmak ve 1 dakika 95 x g tekrar Santrifüjü. 3,5 adım tekrarı ile IHO baz büyüme medyasında 2x hücreleri yıkayın. Hücreleri temel büyüme orta (~ 300 – 500 μL) küçük bir hacimde resuspend ve 1,5 mL Bodrum membran matris için bu çözümün yaklaşık 100 μL ekleyin. Bu süre zarfında, RT ‘de hızla odaklanmaya başlayacağı için matrisin buzda kalması gerekir. 37 °C ‘ de bir plaka ısıtıcı üzerinde 24-kuyu plaka ayarlayın ve 24-kuyu plakasının bir iyi içine 60 μL nokta. Kısaca ayarlanmasına izin verin ve mikroskobun altında yoğunluğu kontrol edin. Gerekirse, istenilen konsantrasyon elde kadar artışlarla Bodrum membran matris daha hindgut çözüm ekleyin ve kalan kuyuları içine çözüm spot. 37 °C ‘ de 10 dakika boyunca inkübe; daha sonra, aşağıdaki konsantrasyonlarda 24 kuyu plakasının her bir kuyusu için büyüme faktörleri içeren 800 μL iHO baz büyüme ortamını ekleyin (bkz. Tablo 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml epidermal büyüme faktörü (EGF), 3 μm CHIR99021, 2,5 μm prostaglandin E2 ve 10 μM Y-27632 Dihidroklorür monohidrat (kaya inhibitörü). IHO temel büyüme ortamını her 2 – 3 günde bir veya medya renk kesilmeye başlarsa hemen değiştirin. Bodrum membran matriks içine ilk tohumlama sonra, ıhos 7 gün onları bölme önce geliştirmek için izin verin. 3-4 gün, farklı küreler kültürde görünür olmalıdır. Tek başına medya değişikliği için, Y-27632, bu sadece bölme/tohumlama sırasında gerekli olarak atlayın. 4. iHOs ‘ın bakım ve geçişi Kademeli olarak çözülmesine izin vermek için, 4 °C ‘ de kapalı bir buz kovasında Bodrum membran matrisinin gerekli hacmini çıkarın, bölme işleminden önce 24 saat. Ihos medyasını çıkarın ve 500 μL hücre kaldırma çözeltisi ile değiştirin (bkz. malzeme tablosu) başına iyi. 4 °C ‘ de 40 – 50 dakika boyunca Inküye edin, bu noktada ıhos çözeltinin içinde yüzen olmalıdır. İsteğe bağlı: istenilen morfoloji ile sadece iHOs seçmek için bir in-Hood görüntüleme sistemi kullanın ( malzeme tablosunabakın). IHO/hücre kaldırma çözeltisi süspansiyonu 15 mL konik tüplere hafifçe pipet, ıhos kırmak için değil çalışıyor. Ihos 3 – 5 dk yerleşmek ve süpernatant ve tek hücreleri kaldırmak için izin verin. İHOs ‘ın 5 mL ‘Lik iHO tabanı büyüme ortamına resuspend ve onları yavaşça yıkamak için pipet. 95 x g ‘de santrifüjün 2 dk. 37 °C ‘ de plaka ısıtıcı üzerinde 24 kuyu plakası ayarlayın. Süpernatant kaldırmak ve ıhos pelletini ~ 300-500 μL temel büyüme medya, bir P1000 pipet küçük parçalar halinde ihos kırmak için kullanarak. Uygulanması gereken gücün IHO hattına ve olgunlaşma durumuna bağlı olarak değişebileceğini unutmayın, bu nedenle yavaşça başlayın, gerekirse kuvveti arttırın. Yer ~ 100 μL ıhos (hacim çözeltinin yoğunluğuna bağlıdır) içine 1,5 mL Bodrum membran matris ve pipet kısaca karıştırmak için. Spot dışarı 1 x 60 μL Bodrum membran matris bir iyi 24-kuyu plaka içine, ~ 30 s için katılaşma için bırakın ve sonra mikroskop altında yoğunluğu kontrol edin. Yoğunluk çok düşükse, matrisine daha fazla ıhos ekleyin. Doğru yoğunluğa ulaşılana kadar adım 4,8 yineleyin ve ardından matrisin geri kalanını 24-kuyu plakasına yerleştirin. 10 dakika için 37 °C ‘ de bir kuluçla yerleştirin ve sonra, adım 3,7 ‘ de açıklandığı gibi, büyüme faktörleri ile 800 μL baz büyüme ortamı ile bindirin. Bir istila tahlil deneyi için ıhos hazırlamak için (aşağıda özetlenmiştir), Passage ıhos 4 – 5 gün önce deneme adımları açıklandığı gibi 4.1 – 4.10, ama yer 120 μL matris iHO çözüm içinde oluşturulan 5 mm cam dipli mikroenjeksiyon yemekleri içine adım 4,7. Rutin geçişte olduğu gibi bir damlacık içinde IHO süspansiyon bırakarak yerine, matris ince bir tabaka oluşturmak için çanak alt üzerine damlacık yayıldı. 2,5 mL temel büyüme orta artı büyüme faktörleri ile kapak.Not: Kültür ortamında antibiyotikler kullanılmışsa, mikroenjeksiyon deneyleri için antibiyotik olmayan tamamlayıcı medya ile değiştirilmelidir. 5. rhIL-22 ile iHOs ‘un prestimulation Ihos gelen medya aspirate ve taze temel büyüme medya ile yerine (Antibiyotik içermeyen gerekir) 18 invazyonu tahlil önce saat. RhIL-22 ‘ i kültür ortamına 100 ng/mL son konsantrasyonuna ekleyin. 6. ıhos ve hücre içi Istilanın Mikroenjeksiyonu Deneyden önceki gün, S’i ayarlayın. 10 mL Luria-Bertani suyu içinde typhimurium SL1344 kültürü ve 37 °C ‘ de inküyeler sallama ile gece. Deney gününde, kapalı bir ısı odası olan bir mikroskop varsa, onu açın ve sıcaklığın 37 °C ‘ ye ulaşmasına izin verin. DPBS (CA ve mg içeren) bir gece bakteriyel kültürler seyreltmeli 2 ‘ de 600 Nm (OD600) bir optik yoğunluğa ve daha sonra, o 1:1 fenol kırmızı ile karıştırın. Ihos içeren mikroenjeksiyon tabağı mikroskop aşamasına yükleyin, kapağı çıkarın ve iHOs ‘a enjeksiyonu başlamak için hazır hale getirin. Enjektör ve kol kontrol istasyonlarını açın. Enjektör 600 kPa basınç ve 0,5 s bir enjeksiyon süresi ayarlandığından emin olun. Zaten mikroskop aşamasından yedeklenmez ise, emin olmak için enjeksiyon kolunu döndürün. Sarma ve iğne plastik silindir kaldırarak 6 μm mikroenjeksiyon matkap ucu ayarlayın. Kavrama kafasını enjeksiyon kolundan çıkarın. Matkap ucunu inoculum ile 10 μL ile yükleyin, matkap ucunu hafifçe künt ucuna sürükler. Matkap ucunu kavrama kafasına yerleştirin ve mikroenjeksiyon koluna yeniden takın. İğnenin mikroenjeksiyon tabağı 1 – 2 cm üzerinde olması için kolu yavaşça konuma getirin. İğne ucunu çanak ortasına konumlandırmak için kol kontrolünü kullanın ve sadece medyanın yüzeyinin üzerinde olana kadar aşağı indirin. Tüm enjeksiyonları sonra bu noktaya iğne dönmek için kol kontrol istasyonu programı. Ihos üzerinde mikroskop odaklanmak ve enjekte etmek için hedef seçin. Enjekte edilmesi ve iğne aşağı ve yanal IDEO lümen içine taşımak için sadece yukarıda ve IHO sağında iğne konumlandırın. Mikroenjektör üzerinde enjekte düğmesine basın; Fenol-lekeli bakteriyel karışımı iğne ortaya çıkacak. Her IHO 3x enjekte. Her koşul için en az 30 ıhos enjekte edilir.Not: IHO boyutu ve yapısı içinde heterojenlik nedeniyle bir kültür içinde çok sayıda enjekte etmek gereklidir ıhos değişimi için kontrol etmek. Gerekli tüm ıhos enjekte edildiğinde, sahneden mikroenjeksiyon plakasını çıkarın, kapağı değiştirin ve 37 °C ‘ de 90 dakika boyunca plakayı inküd. 90 dk sonra, büyüme medya Aspire ve hücre kaldırma çözeltisi 3 ml ile değiştirin; 45 dk. için 4 °C ‘ de inkübe Ihos/hücre kaldırma çözümünü, 5 mL DPBS içeren 15 mL konik tüpüne yavaşça taşıyın. Tüm enjekte ıhos plaka kaldırıldı emin olun (gerekirse DPBS 1 mL ile plaka durulayın). 370 x g ‘de 3 dakika Santrifüjü 0,1 mg/ml ‘de gentamin içeren temel büyüme medyasında süpernatant ve pelletini ıhos kaldırın (1 ml medya ekleyin; daha sonra, ıhos kırmak için bir P1000 pipet ~ 50x kullanın ve 4 ml daha fazla medya ekleyin). 37 °C ‘ de 1 saat boyunca inkükülüler bakterileri öldürmek. 3 dakika için 370 x g ‘de ıhos santrifüjler ve mümkün olduğunca az bırakarak, supernatant Aspire. Ihos 1x ‘i DPBS ve santrifüjlerle yıkayın.Not: Bu adım gentaminisi kaldırır, herhangi bir kalan gentaminisin hücreler lysed sonra hücre içi bakteri öldürebilir gibi önemlidir. 500 μL lizis Buffer ( malzeme tablosunabakın) içinde ıhos resuspend ve elle pipetleme ~ 50x tarafından organoids ayırmak. Bu karışımı RT ‘de 5 dakika boyunca bırakın. Seri olarak, 10-1, 10-2ve 10-3 konsantrasyonları oluşturmak için dpbs ‘de ortaya çıkan çözüm 10 kat seyreltin. Prewarmed LB agar plakaları üzerine temiz ve seyreltilmiş çözümlerin 3 x 20 μL damlacıkları pipet. Bir gecede 37 °C ‘ de inküyün ve koloniye sayım ve koloni oluşturan birimlerin (CFU) hesaplanması gerçekleştirin. Koloni sayısı, hücre parçalanması sürecinde yayımlanan hücreler arası bakterilerin numaralarını yansıtacaktır. 7. hücre donma ve kurtarma Not: Daha önce belirtildiği gibi, cryogenically iHOs korumak ve istenilen zaman onları yeniden oluşturmak mümkündür. Donma ve çözme süreçleri aşağıda özetlenmiştir. Dondurmak istediğiniz ıhos ‘un kuyularını seçin. Kuyulara hücre kaldırma çözeltisi ekleyin ve 4 °C ‘ de 40 – 50 dakika boyunca inkübe edin. Ihos çözüm yüzen olmalıdır. Iyhos ‘i 15 mL konik tüpüne hafifçe pipet atın ve yerleşmelerine izin verin. Medyayı çıkarın ve ıhos 1x ‘i temel büyüme medyaları ile yıkayın (büyüme faktörleri yoktur). Santrifüjler at 95 x g için 2 dakika, supernatant kaldırmak, ve hücre donma orta uygun bir hacim ile değiştirmek (malzeme tablosuna bakın; üreticinin talimatlarına göre orta kullanın), kriyojenik şişeleri Içine ıhos dekreme. Daha kademeli donma sağlamak için gece-80 °C dondurucu gecede şişeleri saklayın; sonra, sıvı azot depolama aktarmak. Ihos ‘u yeniden oluşturmak için, 37 °C ‘ de su/boncuk banyosu kullanarak kriyojenik bir şişenin hızla defrost; ardından, içeriğini 10 mL ‘Lik temel büyüme ortamına hafifçe pipet (büyüme faktörü yok). Ihos ‘un yerleşmesine izin verin ve ortamı ~ 300 yeni temel büyüme medyası ile değiştirin. El ile ihos DISSOCIATE etmeyin. İHOs ‘i Bodrum membran matrisine ekleyin ve Bölüm 3 ‘ te açıklandığı gibi plakaya çıkarın.