Evaluering av Synaptic mangfold bruker hele-celle Patch-klemme elektrofysiologi

Synaptiske overføring er en fundamental mekanisme for kommunikasjon mellom nerveceller, og derfor hjernefunksjonen. Synaptiske overføring er også labilt og kan endre effekt i en aktivitet-avhengige måte også som svar på modulatory signaler¹. Derfor har undersøke synaptiske funksjon vært et viktig fokus nevrovitenskap forskning. Hele celle oppdateringen klemme elektrofysiologi er en allsidig teknikk som gjør det muliggjør for oss å forstå, utarbeide eksperimentell design og data analyser, grundig Biofysiske og molekylære mekanismer av synaptic overføring. En brukte tilnærming, kanskje på grunn av enkelhet av teknikk og konsept, er måling av miniatyr eksitatoriske/hemmende postsynaptic strøm (meg / IPSCs) under spenning klemme konfigurasjon^{2,3, 4 , 5 , 6}. individuelle mPSCs representerer flyten av ioner gjennom postsynaptic ionotropic reseptorer (f.eks AMPA og GABA_A reseptorer) svar binding av sine respektive nevrotransmittere utgitt fra presynaptic terminal ⁷ . Fordi opptaket er oppnådd i nærvær av spenning-gated Na⁺ kanal blokkering tetrodotoxin (TTX), utgivelsen er handlingen potensial-uavhengig og innebærer vanligvis en enkelt synaptic vesicle som inneholder nevrotransmitter. Basert på denne forutsetningen, er gjennomsnittlig amplituden til mPSCs mye brukt som en grov anslag for quantal størrelsen, som representerer antallet og funksjonaliteten til postsynaptic reseptorer motstridende en singelutgivelse nettsted. Frekvensen for mPSCs regnes derimot, representerer en kombinasjon av antall synapser avslutning på postsynaptic cellen og deres gjennomsnittlige utgivelsen sannsynlighet. Men disse parameterne ikke mål en annen variabel-multiplicativity synapser eller synaptic mangfold, som er viktig for effekten av synaptic overføring.

Basert på quantal teorien om synaptic overføring^7,8,9, styrken i en gitt sammenheng mellom neurons er avhengig av tre faktorer: antall funksjonelle synapser (N), den postsynaptic svar på utgivelsen av en enkelt synaptic vesicle (quantal størrelse; Q) og sannsynligheten for nevrotransmitter-løslate (P-_r). Synaptiske mangfold tilsvarer N. Utviklingen av synaptic mangfold eller beskjæring av multiplikativ synapser er plast i utvikling og i ulike sykdom stater^3,4,6,10. Derfor har karakteriserer synaptic mangfoldet viktige implikasjoner for å forstå effekten av synaptic overføring i helse og sykdom. Teknikker, som elektronmikroskop kan identifisere strukturelle bevis på synaptic mangfold av oppdager flere synaptic kontakter fra samme axon på de samme postsynaptic Nevron^{11,12, 13,14}. Disse strukturelt identifisert multisynapses kan imidlertid være funksjonelt stille^15,16. Presis funksjonelle undersøkelse av N krever teknisk utfordrende elektrofysiologiske tilnærminger, slik som sammenkoblede hele celle innspillinger som kan identifisere om en gitt tilkobling har flere funksjonell løslate områder og minimal stimulering tilnærminger som mål å rekruttere et enkelt antatte axon.

I denne protokollen beskriver vi en enkel metode for å estimere synaptic mangfold ved å vedta en metode opprinnelig utviklet av Hsia et al². Denne teknikken innebærer måling av spontane PSCer (sPSCs) og mPSCs med hele celle oppdateringen klemme elektrofysiologi, som tillater oss å estimere graden av synaptic mangfold på tvers av alle innganger til en gitt Nevron.  Som tidligere definert, synaptic mangfold gjenspeiler antall synapser mellom en gitt før og postsynaptic Nevron. Hvis flere synapser er rekruttert i synkronisering av en handling potensial, blir det en høy sannsynlighet for timelige summering av personlige (dvs. quantal) PSCer, genererer en større amplitude PSC.  I mPSC opptak (i hvilken handling potensialer blokkeres av TTX), sannsynligheten for timelige summering av personlige (ikke-synkron) mPSCs er lav. Bruker denne begrunnelsen, kan synaptic mangfold beregnes ved å sammenligne sPSC amplituden (med handlingen potensial-avhengige utgivelse) til mPSC amplituden.

For å undersøke eksistensen av mangfold beskriver vi fire eksperimenter og deres analyser med glutamatergic EPSCs som eksempel. Imidlertid den samme fremgangsmåten kan brukes for rask GABAergic/glycinergic-overføring (IPSCs). En kort begrunnelse for hvert eksperiment beskrives nedenfor. Som forklart ovenfor, kan først synaptic mangfold beregnes ved å sammenligne amplituden til sEPSCs til mEPSCs. Det er to krav til denne tilnærmingen; 1) presynaptic axons må skyte et tilstrekkelig antall handling potensialer under opptak, og 2) P_r må være høy slik at flere synapser løslate nevrotransmitter ved ankomsten av en handling potensial. For å møte disse kravene, er sEPSCs første gang registrert i lav Ca^{2 +} kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), og deretter registreres i nærvær av en lav konsentrasjon av K⁺ kanal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) øke handling potensielle skyte og P_r. Handlingen potensial avfyring blokkeres av TTX og Pr redusert med en spenning-gated Ca^{2 +} kanal blokker Cd^{2 +}. Amplituden til sEPSCs (med 4AP) er sammenlignet med mEPSC (4AP, TTX og Cd^{2 +}). I andre forsøket, er Ca^{2 +} erstattet av ekvimolare Sr^{2 +} i aCSF å desynchronize vesicle utgivelsen. Ca^{2 +} er nødvendig for synkron utgivelsen av blemmer, bør erstatning med Sr^{2 +} fjerne den store amplituden sEPSCs som mangfold. Tredje mechanistically, mangfold kan resultere fra flere synaptic kontakter til samme postsynaptic Nevron eller multivesicular release (dvs. flere blemmer utgitt innen en enkelt synaptic kontakt)^17,18. For å skille mellom de to typene mangfold, bruker tredje forsøket en lav affinitet, rask dissociating konkurransedyktig antagonist av AMPA reseptorer, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 til å bestemme om store sEPSC er et resultat av timelige summering av uavhengige synapser eller multivesicular løslate opptrer på en overlappende befolkning på postsynaptic reseptorene. Hvis store amplituden hendelsene oppstår fra multivesicular utgivelse, blir γ-DGG mindre effektiv på hemme større sammenlignet med mindre sEPSCs, mens store sEPSCs som oppstår fra timelige summering av flere synaptic kontakter vil bli like påvirket av DEN BLE-DGG. I fjerde forsøket brukes en mer fysiologiske metoden til å forbedre handling potensial skyting, nemlig afferente synaptic stimulering. Pakker med synaptic aktivitet kan transiently økning/lette spontan handling potensial skyting og slipp sannsynligheten stimulert afferente. Derfor kan denne tilnærmingen mangfold å manifestere i en mer fysiologiske måte.

Følgende protokollen beskriver metoden for å gjennomføre disse eksperimentene i musen hypothalamus vev. Spesielt brukes corticotropin slippe hormone (CRH) nevroner i paraventricular kjernen i hypotalamus (PVN). Vi beskriver fremgangsmåtene for å gjennomføre hele celle oppdateringen klemme electrophysiology og forklare de bestemte eksperimentene for å teste for synaptic mangfold.