Utvärdering av Synaptic Multiplicity använder hela-cell Patch-clamp elektrofysiologi

Synaptisk transmission är en grundläggande mekanism för kommunikationen mellan nervceller, och därmed hjärnans funktion. Synaptisk transmission är också labila och kan ändra dess effektivitet i en verksamhet-beroende sätt också som svar på immunmodulerande signaler¹. Således har att pröva synaptic funktion varit viktiga fokus av neurovetenskapliga forskning. Hela-cell patch clamp elektrofysiologi är en mångsidig teknik som gör det möjligt för oss att förstå, genom att utarbeta experimentell design och dataanalyser, djupgående biofysiska och molekylära mekanismer av synaptisk transmission. En vanligt förekommande strategi, kanske på grund av enkelheten i tekniken och konceptet, är mätning av miniatyr excitatoriska/hämmande postsynaptiska strömmar (mig / IPSCs) under spänningen klämma konfiguration^{2,3, 4 , 5 , 6}. individuella mPSCs representerar flödet av joner genom postsynaptiska jonotropa receptorer (t.ex. AMPA och GABA_A -receptorer) som svar på bindningen av deras respektive neurotransmittorer frigörs från presynaptiska terminalen ⁷ . Eftersom inspelningen erhålls i närvaro av de spänningskänsliga Na⁺ kanal blockerare tetrodotoxinen (TTX), utgivningen är oberoende av aktionspotential och innebär normalt en enda synaptiskt vesikelprotein som innehåller signalsubstansen. Baserat på detta antagande, används genomsnittliga amplituden av mPSCs allmänt som en grov uppskattning för den kvantfysikaliska storlek, vilket representerar antalet och funktionalitet av postsynaptiska receptorer motsätta sig en enda utsättningsplatsen. Frekvensen av mPSCs anses däremot, utgör en kombination av det totala antalet synapser avslutas på den postsynaptiska cellen och deras genomsnittliga release sannolikhet. Dessa parametrar mäter dock inte en annan variabel-multiplicativity av synapser, eller synaptic multiplicity — vilket är viktigt för effekten av synaptisk transmission.

Baserat på kvantfysikaliska teorin av synaptisk transmission^7,8,9, styrkan i en viss anslutning mellan ett par av nervceller är beroende av tre faktorer: antalet funktionella synapser (N), den postsynaptiska svar till frigöraren av en enda synaptiskt vesikelprotein (kvantfysikaliska storlek; Q) och probabilityen av neurotransmitterfrigöraren (P_r). Synaptic multiplicity motsvarar N. Utvecklingen av synaptic multiplicity eller beskärning av multiplikativ synapser är plast i hela utvecklingen och i olika sjukdomen staterna^3,4,6,10. Av denna anledning har kännetecknar synaptic multiplicity stor betydelse för att förstå effekten av synaptisk transmission i hälsa och sjukdom. Tekniker, såsom elektronmikroskopi kan identifiera strukturella bevis av synaptic multiplicity genom att upptäcka flera synaptiska kontakter med ursprung från samma axon på samma postsynaptiska neuron^{11,12, 13,14}. Dessa strukturellt identifierade multisynapses kan dock vara funktionellt tyst^15,16. Exakt funktionell undersökning av N kräver tekniskt utmanande elektrofysiologiska metoder, såsom Parade hela-cell inspelningar som kan fastställa huruvida en viss anslutning har flera funktionella release webbplatser och minimal stimulering strategier som syftar till att rekrytera en enda förmodade axon.

I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att uppskatta synaptic multiplicity genom att anta en metod som ursprungligen utvecklades av Hsia et al². Denna teknik innebär mätning av spontana PSC (sPSCs) och mPSCs med hela-cell patch clamp elektrofysiologi, som tillåter oss att uppskatta graden av synaptic multiplicityen över alla ingångar till en given neuron.  Som tidigare definierade, synaptic multiplicity återspeglar antalet synapser mellan en given pre- och postsynaptiska neuron. Om flera synapser rekryteras på samma gång av en aktionspotential, blir det en hög sannolikhet för temporal summering av enskilda (dvs kvantfysikaliska) gemensamma kontaktpunkter, genererar en större amplitud PSC.  I mPSC recordings (i vilken handlingspänningar blockeras av TTX), sannolikheten för temporal summering av enskilda (icke-synkrona) mPSCs är låg. Med denna logik, kan synaptic multiplicity uppskattas genom att jämföra sPSC amplituden (med potentiell handling-beroende release) till mPSC amplituden.

För att undersöka förekomsten av multiplicity beskriver vi fyra experiment och sina analyser med glutamaterg EPSCs som exempel. Dock samma tillvägagångssätt kan användas för snabb GABAergic/glycinergic överföring (IPSCs). En kortfattad motivering för varje experiment beskrivs nedan. Först, som förklarats ovan, synaptic multiplicity kan uppskattas genom att jämföra amplituden av sEPSCs till mEPSCs. Det finns två krav för detta tillvägagångssätt; 1) presynaptiska axoner måste avfyra ett tillräckligt antal handlingspänningar under inspelningen, och 2) P_r måste vara hög så att flera synapser frigöra signalsubstansen vid ankomsten av en aktionspotential. För att möta dessa krav, sEPSCs först registreras i låg Ca^{2 +} konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF), och sedan registreras i närvaro av en låg koncentration av K⁺ kanal antagonisten, 4-Aminopyridin (4-AP) att öka åtgärd potentiella bränning och P_r. Då blockeras aktionspotential bränning av TTX och Pr minskade med en spänningskänsliga Ca^{2 +} kanal blockerare Cd^{2 +}. Amplituden av sEPSCs (med 4AP) jämförs med det av mEPSC (med 4AP, TTX och Cd^{2 +}). I det andra experimentet ersättas Ca^{2 +} med equimolar Sr^{2 +} i aCSF till desynchronize vesikler release. Ca^{2 +} krävs för synkrona frigöraren av blåsor, bör ersättning med Sr^{2 +} eliminera den stora amplitud sEPSCs som är vägledande för mångfald. För det tredje, slentrianmässigt, multiplicity kan följd antingen flera synaptiska kontakter till samma postsynaptiska neuron eller multivesicular release (dvs flera blåsor släppas inom en enda synaptisk kontakt)^17,18. För att skilja mellan de två typerna av multiplicity, använder tredje experimentet en låg affinitet, snabb separera kompetitiv antagonist till AMPA-receptorer, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 att avgöra om stora sEPSC är resultatet av den temporal summeringen av oberoende synapser eller multivesicular release agerar på en överlappande befolkning av postsynaptiska receptorer. Om de stora amplitud händelserna uppstår från multivesicular release, kommer att γ-DGG vara mindre effektiva på att hämma större jämfört med mindre sEPSCs, medan stora sEPSCs som uppstår från den temporal summeringen av flera synaptiska kontakter påverkas på samma sätt av Γ-DGG. I fjärde försöket används en mer fysiologisk metod att förbättra aktionspotential bränning, nämligen afferenta synaptic stimulering. Skurar av synaptisk aktivitet kan övergående ökning/underlätta spontana aktionspotential bränning och release sannolikheten att den stimulerade afferenter. Därför, detta tillvägagångssätt tillåter mångfald manifesteras på ett mer fysiologiska sätt.

Följande protokoll beskriver metoden för att genomföra dessa experiment i mus hypotalamus vävnad. Specifikt, används kortikotropin frigöra hormon (CRH) nervceller av paraventricular kärnan i hypothalamus (PVN). Vi beskriva förfarandena för att genomföra hela-cell patch clamp elektrofysiologi och förklara de specifika experiment att testa för synaptic multiplicity.