הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה

הסינאפסית הוא מנגנון בסיסי עבור תקשורת בין נוירונים, לפיכך, תפקוד המוח. הסינאפסית גם יציב, באפשרותך לשנות את יעילותה באופן תלוי-פעילות כמו גם כמו בתגובה אותות modulatory¹. לפיכך, בחינת תפקוד סינפטית היה מוקד מרכזי של חקר המוח. אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון כל תא הוא טכניקה תכליתי המאפשר לנו להבין, על-ידי להמציא עיצובים מוטוריים וניתוחים נתונים, מעמיק מנגנונים biophysical ומולקולרית של ההעברה הסינאפסית. בגישה נפוץ, אולי בשל הפשטות של טכניקה, קונספט, הוא המדד של זרמי postsynaptic סינאפסות מעכבות מיניאטורי (בי / IPSCs) תחת המתח תהדק את תצורת^{2,3, 4 , 5 , 6}. mPSCs בודדים לייצג את הזרימה של יונים דרך רצפטורים postsynaptic ionotropic (למשל קולטנים אמפא ו- GABA_A ) בתגובה הכריכה של נוירוטרנסמיטורים בהתאמה שלהם שוחרר ממסוף presynaptic ⁷ . כי ההקלטה מתקבל בנוכחות ממותגת מתח Na⁺ ערוץ חוסם טטרודוטוקסין (TTX), שחרורו אינו תלוי-פוטנציאל הפעולה, בדרך כלל כרוך שלפוחית סינפטית יחיד המכיל עצבי. בהתבסס על הנחה זו, משרעת הממוצע של mPSCs הוא בשימוש נרחב הערכה גסה עבור גודל quantal, המייצגת את המספר ואת הפונקציונליות של קולטנים postsynaptic מנוגדות אתר שחרור יחיד. מצד שני, התדירות של mPSCs נחשבת מייצגים שילוב של המספר הכולל של הסינפסות הפסקת אל התא postsynaptic והסתברות שחרור הממוצע שלהם. עם זאת, פרמטרים אלה לא מאפשרות למדוד משתנה נוסף-multiplicativity של הסינפסות, או ריבוי סינפטית – דבר חשוב היעילות של ההעברה הסינאפסית.

בהתבסס על תורת הסינאפסית^7,8,9quantal, הכוח של חיבור נתון בין זוג נוירונים הוא תלוי בשלושה גורמים: המספר של הסינפסות פונקציונלי (N), postsynaptic בתגובה שחרורו של שלפוחית סינפטית יחיד (גודל quantal; Q), ההסתברות של שחרור נוירוטרנסמיטר (P_r). ריבוי סינפטית שווה ל N. הפיתוח של ריבוי סינפטית או על גיזום של הסינפסות אוילר הוא פלסטיק במהלך הפיתוח, מחלות שונות הברית^3,4,6,10. מסיבה זו, אפיון ריבוי סינפטית יש השלכות חשובות להבנת את היעילות של ההעברה הסינאפסית על בריאות ומחלה. טכניקות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן לזהות ראיות מבניות של ריבוי סינפטית על ידי גילוי מספר מגעים סינפטית שמקורם הדנדריטי לאקסון אותו על גבי אותו נוירון postsynaptic^{11,12, 13,14}. עם זאת, multisynapses מזוהה מבחינה מבנית האלו ניתן באופן פונקציונלי שקט^15,16. ירידה תפקודית מדוקדקת של N דורש טכנית מאתגר גישות אלקטרופיזיולוגיות, כגון הקלטות שלם-תא לזווג אשר יכול לזהות אם חיבור נתון יש מספר אתרי פרסום פונקציונלי מינימלית גישות גירוי שואפים לגייס של האקסון בשם יחיד.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור הערכת ריבוי סינפטית על ידי אימוץ שיטה שפותחה במקור מאת Hsia ואח ‘². טכניקה זו כרוכה המדידה של ספונטנית מגירסה (sPSCs), mPSCs באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה, אשר מאפשר לנו לאמוד את מידת הריבוי סינפטית על-פני כל כניסות ליציאה נוירון מסוים.  כפי שהוגדרו בעבר, סינפטית ריבוי משקף את המספר של הסינפסות בין נוירון קדם ו postsynaptic נתון. אם הסינפסות מרובים גייסו בסנכרון ידי פוטנציאל הפעולה, תהיה הסתברות גבוהה של סיכום זמני של הפרט מגירסה (קרי quantal), יצירת של משרעת גדולה PSC.  בהקלטות mPSC (איזה פוטנציאל פעולה הנחסמים על-ידי TTX), ההסתברות של סיכום זמני של הפרט mPSCs (שאינם סינכרוני) הוא נמוך. באמצעות רציונל זה, ריבוי סינפטית יכול להיות מוערך על-ידי השוואת את משרעת sPSC (עם פוטנציאל הפעולה תלוית שחרור) משרעת mPSC.

כדי לבחון את קיומו של ריבוי אנו מתארים ארבעה ניסויים וניתוחים שלהם glutamatergic EPSCs כדוגמא. לעומת זאת, אותה גישה יכול לשמש עבור הצום שידור GABAergic/glycinergic (IPSCs). תירוץ קצר עבור כל הניסוי המתואר להלן. ראשית, כפי שהוסבר לעיל, יכול להיות מוערך ריבוי סינפטית על-ידי השוואת את משרעת של sEPSCs כדי mEPSCs. ישנם שתי דרישות גישה זו; אקסונים presynaptic 1) חייב לירות מספר מספיק של פוטנציאל פעולה במהלך ההקלטה, ועל 2) P_r להיות גבוהה כך הסינפסות מרובים שחרור נוירוטרנסמיטר בעת ההגעה של פוטנציאל הפעולה. על מנת לעמוד בדרישות אלה, sEPSCs הן שהוקלט לראשונה ב נמוך Ca^{2 +} מלאכותי השדרתי (כלנית חדד), לאחר מכן הקליט בנוכחות ריכוז נמוך של אנטגוניסט ערוץ K⁺ , פמפרידין (4-AP) כדי להגדיל את הפעולה ירי פוטנציאל ו- P_r. ואז פוטנציאל הפעולה ירי חסומה על-ידי TTX ו- Pr הופחתו ממותגת מתח Ca^{2 +} ערוץ חוסם Cd^{2 +}. משרעת של sEPSCs (עם 4AP) בהשוואה לזה של mEPSC (עם 4AP, TTX ו Cd^{2 +}). הניסוי השני, Ca^{2 +} מוחלף על-ידי equimolar Sr^{2 +} ב חנה המבר כדי בטל סינכרון שלפוחית שחרור. כפי Ca^{2 +} נדרש לשחרור סינכרונית של שלפוחית, החלפת עם Sr^{2 +} אמור לחסל את sEPSCs משרעת גדולה זה מרמז על ריבוי. שלישית, mechanistically, ריבוי יכול לנבוע גם קשרים סינפטיים מרובים באותו נוירון postsynaptic או שחרור multivesicular (קרי מספר שלפוחית שוחרר איש קשר סינפטית יחיד)^17,18. כדי להבדיל בין שני סוגים של ריבוי, הניסוי השלישי משתמש עם זיקה נמוכה, מהיר בריא תחרותי אנטגוניסט של אמפא רצפטורים, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 כדי לקבוע אם גדול sEPSC הם התוצאה של סיכום טמפורלית הסינפסות עצמאית או שחרור multivesicular פועל על אוכלוסיה חופפים של קולטני postsynaptic. אם האירועים משרעת גדולה נובעים שחרור multivesicular, וγ-DGG יהיה פחות יעיל עיכוב sEPSCs בהשוואה קטן יותר גדול יותר, ואילו sEPSCs גדולים הנובעים מן הסיכום הטמפורלי של אנשי קשר מרובים סינפטית יושפעו באופן דומה על-ידי Γ-DGG. במהלך הניסוי הרביעי, שיטה יותר פיזיולוגית משמש כדי לשפר את פוטנציאל הפעולה בירי, כלומר מביא לגירוי סינפטית. התפרצויות של פעילות סינפטית יכול transiently עלייה/להקל על פוטנציאל הפעולה הספונטנית ירי ושחרור ההסתברות afferents מגורה. לכן, גישה זו מאפשרת ריבוי להפגין בצורה יותר פיזיולוגית.

הפרוטוקול הבא מתאר את שיטת עבור ניסויים אלה ברקמת היפותלמי העכבר. באופן ספציפי, משמשים corticotropin נוירונים הורמון (CRH) שיחרור של גרעין paraventricular ההיפותלמוס (PVN). אנו מתארים את נהלי ביצוע תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה, להסביר את הניסויים ספציפיים כדי לבדוק את הריבוי סינפטית.