JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Immunologie et infection

Medição de taxas de mistranslation micobacterianas específicas com sistemas de repórter de ganho de função

Published: April 26, 2019
doi:
10.3791/59453
, , ,
1Centre for Global Health and Infectious Diseases, Collaborative Innovation Centre for the Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases,Tsinghua University School of Medicine

Summary

Neste artigo, nós apresentamos dois métodos complementares para medir taxas específicas do erro translacional e do Tradução no modelo Mycobacterium, smegmatis do Mycobacterium, usando sistemas do repórter do ganho–função. Os métodos podem ser empregados para medir taxas de erro precisas em baixa taxa de transferência ou taxas de erro relativas em uma configuração mais alta taxa de transferência.

Abstract

A tradução de genes em proteínas é propensa a erros. Embora a taxa média de erro translacional em sistemas modelo seja estimada em 1/10000 por Codon, as taxas de erro reais variam muito, dependendo da espécie, do ambiente e dos códons estudados. Nós mostramos previamente que os micobactérias usam um caminho de duas etapas para a geração de tRNAs aminoacylated do glutamina e do asparagina e que este está associado especificamente com as taxas de erro relativamente elevadas devido à modulação de taxas do Tradução por um componente essencial da via, a amidotransferase GatCAB. Nós modificamos um sistema previamente empregado da duplo-luciferase do renilla-Firefly que fosse usado para medir taxas do tradução em Escherichia coli para o uso nas micobactérias para medir taxas de tradução específicas do glutamato na glutamina códons e aspartato para códons de asparagina. Embora este sistema do repórter fosse apropriado para a estimativa exata de taxas de erro específicas, a falta da sensibilidade e das exigências para etapas de manipulação excessivas fêz impróprio para aplicações da elevado-taxa de transferência. Conseqüentemente, nós desenvolvemos um segundo sistema do repórter do ganho–função, usando o luciferase de nluc e a proteína fluorescente verde (GFP), que é mais passíveis às configurações do Medium/high-throughput. Nós usamos este sistema para identificar o casugamicina como uma molécula pequena que possa diminuir o mistranslation Mycobacterial. Embora os repórteres que nós descrevemos aqui sejam usados para medir tipos específicos de tradução Mycobacterial, podem ser modificados para medir outros tipos de tradução em um número de sistemas modelo.

Introduction

O fluxo de informações em biologia molecular requer a tradução de informações genéticas para proteínas funcionais. Como em todos os sistemas biológicos, a tradução genética também envolve erros mensuráveis. As estimativas das taxas de erro na tradução são tipicamente citadas como aproximadamente 1/10000 por Codon (revisada por Ribas de Pouplana et al.1). Entretanto, as taxas de erro variam extensamente, de menos de 10-5 a mais de 0.05/Codon1,2,3,4,5. A ampla gama de taxas de erro, abrangendo mais de três ordens de magnitude, é devido ao fato de que os erros podem surgir a partir de várias etapas na via de Tradução: a partir de erros estocásticos, mutacionais, ou induzida por estresse na aminoacilação6, 7 º de , 8 anos de , 9 anos de , 10, misacylation physiological de asparaginyl-e glutaminyl-tRNAs5, ou erros ribosomal da decodificação2,3,11. As taxas de erro mensuravelmente elevadas, representando sobre 0.01/Codon, sugeriram que os erros translacional possam executar funções physiological1,12 e esse tradução pode ser contexto-específico13.

Nós e outros temos demonstrado que erros de ocorrência natural na tradução gênica podem ser adaptativos, especialmente durante o estresse ambiental1,5,12,14,15,16 ,17,18. Em micobactérias, os erros gerados pela via indireta de duas etapas de glutamina/asparagina tRNA aminoacilação19,20 resultam em uma tolerância notavelmente aumentada para a rifampicina antibiótica antituberculose de primeira linha 5. Conseqüentemente, nós especulamos que diminuir o tradução Mycobacterial com uma molécula pequena pode potenciar a matança pela rifampicina. Nós selecionamos para e identificamos o casugamicina do aminoglicosídeos de ocorrência natural como um composto que poderia diminuir o mistranslation Mycobacterial, potenciar a matança Rifampicin-negociada das micobactérias in vitro e in vivo21, e limitamos o emergência da resistência21do rifampicina, que ameaça o controle global da tuberculose22 -o micróbio patogénico o mais mortal do mundo.

Para estudar o erro translacional, os métodos para a medida do tradução têm que ser empregados. Existem vários métodos que foram desenvolvidos para a medição da desconfiança, cada um com vantagens e desvantagens. Brevemente, métodos baseados em espectrometria de massa de precisão têm várias vantagens, o mais importante é que, com algoritmos mais recentes para a detecção de vários tipos de erro translacional, uma medida relativamente imparcial de tradução pode ser realizada18. No entanto, a espectrometria de massas não é muito adequada para a mensuração de eventos de desconfiança de deamidação — precisamente o tipo de desconfiança que ocorre em micobactérias devido à via de aminoacilação indireta de tRNA propensa a erros. Isso ocorre por causa da deamidação não enzimática de alta frequência que se dá no processamento de amostras para espectrometria de massas23, resultando em um sinal de fundo extremamente alto. Portanto, para a detecção de erros nesta via, os repórteres genéticos de ganho de função oferecem vantagens distintas. Especificamente, os repórteres de ganho de função adequados podem ter taxas de fundo extremamente baixas, permitindo a medição de taxas de erro muito baixas11.

Uma vez que a realização de experimentos com Mycobacterium tuberculosis patogénicos requer instalações especializadas e precauções extras, realizamos a maioria das experiências na Mycobacterium M. smegmatis não patogênicas — e mostramos anteriormente que os resultados entre as duas espécies são amplamente comparáveis5,21. Para mensurar as taxas de desconfiança em micobactérias geradas pela via indireta de aminoacilação de tRNA, modificamos um sistema de dupla luciferase de Renilla-Firefly que havia sido previamente desenvolvido para medir erros de decodificação ribossomal em E. coli 11 para uso em micobactérias. Fizemos três modificações específicas: o repórter original não expressava de forma eficiente em micobactérias e, portanto, a sequência foi otimizada para o Codon, e o C-terminal três aminoácidos da luciferase do vagalume, serina-lisina-leucina, que foi anotado como um sinal de tráfico em alguns sistemas24, foi modificado para isoleucina-alanina-valina25. O repórter original teve um resíduo crítico do lisina no luciferase do Firefly Mutated. Em vez disso, mutou-se um resíduo de aspartato (D120) ou glutamato (E144), criticamente conservado, na Renilla luciferase para asparagina e glutamina, respectivamente25 (Figura 1). O repórter foi subclonado no plasmídeo pUV-tetOR epissomal tetraciclina-inducible (ver tabela de materiais). Repórteres de ganho de função mutam resíduos funcionais criticamente conservados em enzimas/proteínas fluorescentes que os tornam não funcionais11,12. Os erros translacionais (ou teoricamente, transcricionais) que sintetizam a variante funcional da proteína resultarão em atividade enzimática mensurável em um subconjunto de proteínas traduzidas. Para corrigir para a variação na abundância da proteína, o repórter mutação é coexpressado com uma proteína funcional que actue como um benchmark e permita a quantificação exata do ganho–função11. Enquanto o repórter renilla-Firefly Dual-luciferase permitiu a mensuração exata das taxas de tradução micobacterianas específicas5,25 (Figura 2 e seção 1 do protocolo), nós rapidamente percebeu que não é adequado para a triagem média/alta taxa de transferência de moléculas que alterariam a taxa de desconfiança. Isto é devido principalmente a duas razões, a saber, a) a falta relativa de potência de renilla luciferase significou que um mínimo de 1 ml de cultura/amostra Mycobacterial foi exigido para medir taxas do tradução, e b) a exigência para o lysis das pilhas antes à medida da atividade de enzima exigiu a manipulação manual excessiva: as pilhas Mycobacterial têm uma parede e um envelope grossos e multi-camadas da pilha que seja relativamente resistente ao lysis. Portanto, procuramos desenvolver um novo sistema de repórter de ganho de função que pudesse ser usado com pequenos volumes (por exemplo, em um sistema de placas de 96 poços) e não necessitava de lise celular para medições. Utilizou-se a alta potência de nluc luciferase e identificou um resíduo crítico de aspartato que, quando transformado em asparagina, resultou em 2 registros de perda de função (Figura 1). Além disso, o tamanho pequeno de nluc permitiu-o de ter um Tag do sinal da secreção do N-terminal-do antígeno 85a, um antígeno secretado principal nos micobactérias27 -que permitiria que nluc seja secretado no sobrenadante da cultura e contorce a exigência para lise celular. A proteína de referência, GFP, foi expressa a partir do mesmo promotor que o nluc mutado, mas a partir de um vetor integrado (ver a tabela de materiais), e poderia ser medido em células intactas21 (Figura 3). Apesar destas vantagens, o repórter do nluc/GFP (seção 2 do protocolo) igualmente tem desvantagens: a redução relativamente modesta na atividade de nluc (100 vezes) com a mutação de D140N não permitiria a medida de taxas extremamente baixas do tradução, tornando o repórter mais adequado como uma ferramenta de triagem do que para as medições precisas de erro translacional. Além disso, nluc não tem resíduos críticos de glutamato; Conseqüentemente, somente as taxas de erro do asparagine-à-aspartato podiam ser medidas. Os princípios gerais descritos neste trabalho devem permitir que os pesquisadores usem esses repórteres como fizemos ou modificamos os repórteres conforme apropriado para uma medição precisa e/ou facile de outras taxas de erro translacionais específicas em seu sistema modelo de Escolha.

Protocol

1. Renilla-Firefly Dual-luciferase repórter Nota: Para uma representação visual desse método, consulte a Figura 2. Inocular cepas de repórter micobacteriana do estoque de-80 ° c com 2 mL de meio 7H9. O selvagem-tipo duplo-luciferase, assim como estirpes mutação do renilla (repórter), precisa de ser usado para permitir o cálculo de taxas do tradução (veja a etapa 1,7). Agitar a 37 ° c durante 1 a 2 dias até que o OD600 atinja a fase estacionária (OD > 3). Alíquota e diluir a OD600Nm em torno de 0,1-0,5. Para experimentos típicos, use três culturas replicadas biológicas independentes. Anhydrotetracycline (ATC), um indutor análogo do tetraciclina da expressão do repórter (que é controlado por um promotor tetraciclina-inducible) a uma concentração final de 50 ng/ml. Para medir os efeitos da kasugamicina nas taxas de tradução21, adicione diferentes doses de kasugamicina à cultura (ver Figura 4 para as doses indicadas) ao mesmo tempo (nas doses testadas, a kasugamicina não tem atividade antimicrobiana). Observe que é importante incluir pelo menos um controle não induzido para cada repórter. Cultura-induza culturas para 4-6 h em 37 ° c com agitação. Transfira as culturas bacterianas para um tubo de 2 mL e centrifugue a 3.220 x g durante 5 min à temperatura ambiente para reduzir as bactérias. Descarte o sobrenadante. Interrompa as bactérias adicionando 40 μL de tampão de Lise passiva 1x (fornecido por um kit Dual-luciferase), que foi diluído (1:1) em água destilada. Transfira o lisado bacteriano ressuspenso a uma placa branca do 96-well, a um poço por a amostra, e agite-a na temperatura ambiente por 20 minutos.Cuidado: Não incubar mais as bactérias no tampão de lise (por mais de 30 min). Adicionar 80 μL de substrato vagalume a cada poço, agitar por 15 s e medir a luminescência por luminômetro com 1.000 MS como tempo de integração. Utilize um injector automatizado ou uma pipeta multicanal para evitar erros de pipetagem. Adicionar 80 μL de substrato Renilla a cada poço, agitar por 15 s e medir a luminescência por luminômetro com 1.000 MS como tempo de integração. Subtrair a luminescência do fundo-medido usando o selvagem-tipo M. smegmatis (isto é, não contendo repórteres) ou lisado não induzido do repórter-dos valores medidos. Use os valores corrigidos para calcular as taxas de desconfiança de cada condição usando a seguinte equação11,25, onde DN refere-se à atividade na estirpe de repórter mutação: 2. repórter nluc/GFP Nota: Para uma representação visual desse método, consulte a Figura 3. Inocular a estirpe bacteriana do repórter de-80 ° c estoque com 2 mL de meio 7H9. Agitar a 37 ° c durante 1 a 2 dias até que o OD600 atinja a fase estacionária (OD > 3). Subcultura para 50 mL de meio 7H9 e crescer até OD600 atinge a fase estacionária tardia (> 4). Antes de alicitar as bactérias a uma placa de 96 bem, adicione o ATC em uma concentração final de 50 ng/mL e misture bem. A indução da cultura a granel garante que todos os poços contenham a mesma quantidade de indutor e que a indução do repórter seja sincronizada. Aliquot as bactérias a um claro, redondo-fundo 96-bem placa, com 100 μL de volume em cada poço. Para a tela para pequenas moléculas que afetam as taxas de desconfiança, adicione o composto na concentração indicada para selecionar poços. Para os propósitos deste protocolo, use a kasugamicina (em doses indicadas na Figura 5) como ilustração. Adicionar diferentes doses de kasugamicina para selecionar poços (cada grupo experimental deve conter pelo menos duas repetições biológicas). Agite e induza as amostras em 37 ° c para 16-20 h.Nota: É necessário selar a placa com filme. Também, todos os poços da borda precisam de ser enchidos com pelo menos 200 μL da água estéril para limitar a evaporação dos poços de teste. Tome 80 μL de cada poço, utilizando uma pipeta multicanal, e transfira as amostras para uma placa preta de 96 poços (que maximiza a medição do sinal de fluorescência). Meça o sinal GFP pelo luminômetro com 20 ms como o tempo da integração. Depois de medir o sinal GFP, centrifugue a placa em 3.220 x g por 10 min. transferir 50 μl do sobrenadante para uma placa de 96 poços de fundo branco (que maximiza a medição do sinal de luminescência), adicione 50 μL de substrato nluc a cada poço, misture-os bem, e meça a luminescência pelo luminômetro com 1.000 MS como o tempo da integração. Determine a relação nluc/GFP dividindo os valores de luminescência nluc corrigidos pela fluorescência GFP: esta medida (em unidades arbitrárias) é uma medida relativa de aspartato para a tradução de asparagina.

Representative Results

Um desenho animado ilustrando o contorno geral dos dois sistemas de repórter utilizados neste trabalho são mostrados na Figura 1. Uma visão geral da seção 1 do protocolo é mostrada na Figura 2 e uma visão geral da seção 2 na Figura 3. O efeito da kasugamicina na desconfiança micobacteriana é mostrado na Figura 4, conforme medido pelo sistema de repórter renilla-Firefly. Para mostrar a especificidade da ação da kasugamicina, o repórter também foi expressado em uma cepa de M. smegmatis em que o ksga foi excluído (∆ ksga). Ksga é um dimetil transferase do rRNA, e as tensões ksga-suprimidos são relativamente resistentes ao Kasugamycin. A ação da kasugamicina sobre a tradução também foi mensurada pelo repórter nluc/GFP, como mostra a Figura 5. Figura 1 : Desenhos animados que ilustram os dois sistemas do repórter do ganho–função. (A) o sistema repórter renilla-Firefly é composto por duas enzimas luciferase expressas como uma proteína de fusão e o controle de um promotor tetraciclina-inducible. A expressão do selvagem-tipo enzima dupla conduz à atividade mensurável elevada de luciferases do Renilla e do Firefly (parte superior). A mutação de um resíduo crítico do aspartato, D120, em renilla à asparagina rende a enzima de RENILLA (D120N) inativa, mas o luciferase do Firefly é ainda ativo. O mistranslation do asparagina ao aspartato (neste caso, do ASP-tRNA fisiologicamente misacylatedASN tRNA5,21) conduz a uma proporção pequena das proteínas traduzidas do renilla que ganham a atividade, que pode ser medido. A comparação da atividade de renilla/Firefly do repórter mutação comparada com o selvagem-tipo enzima dupla permite o cálculo do asparagina a uma taxa do tradução do aspartato. (B) o sistema de repórter nluc/GFP opera com um princípio semelhante. O gene mutação de nluc (D140N) tem um sinal da secreção do N-terminal derivado do antígeno 85a, uma proteína Mycobacterial segregada principal. Ambos os genes de nluc e de GFP são expressos dos promotores Tetracycline-inducible idênticos, para permitir o uso de GFP como uma referência relativa da expressão. Anote a falta do selvagem-tipo tensão de controle de nluc: Este repórter é usado primeiramente na seleção, onde as medidas de taxas relativas do tradução são suficientes para a tela preliminar. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Esboço de medição da taxa de desconfiança usando renilla-repórter Firefly (seção 1 do protocolo). Culturas frescas de M. smegmatis, transformadas com um plasmídeo expressando os repórteres Dual-luciferase, são cultivadas. A expressão do repórter é induzida, e os compostos ou as circunstâncias investigacionais são testados. Seguindo 4-6 h da expressão do repórter, as culturas são peletizadas e lisadas e os lysates são testados para a atividade da duplo-luciferase. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Esboço de medir a taxa de tradução repórter nluc-GFP (seção 2 do protocolo). Uma cultura fresca de M. smegmatis, transformada com os repórteres de nluc e de GFP, é crescida a um volume suficiente para que todas as placas sejam testadas (supondo a placa do ~ 10 ml/96-well). Imediatamente antes de Pipetar a cultura bacteriana em cada poço, induzir a expressão dos repórteres com ATC adicionado à cultura em massa. Incubar os poços agitando-os durante a noite. Para medir as taxas de desconfiança relativas, transfira as culturas para uma placa preta (para aumentar a sensibilidade da detecção de fluorescência), meça a fluorescência GFP e, em seguida, gire as placas para baixo para pellet as bactérias. Transfira o sobrenadante para uma placa branca para a medição da atividade de nluc. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Resultado representativo do uso do repórter renilla-Firefly medindo a taxa de desconfiança na presença de kasugamicina em diferentes cepas. Taxas de tradução de aspartato para asparagina em (a) selvagem-tipo M. smegmatis e (B) uma estirpe eliminada para ksga (∆ ksga) após o tratamento com kasugamicina (KSG), medida pela renilla-Firefly dual Repórter. As culturas foram tratadas com o casugamicina em doses indicadas (em microgramas/mililitro) para 6 h antes da lise e das medidas da pilha. As relações Ren/FF corrigidas (eixos y) são indicativas do aspartato para as taxas de tradução da asparagina. A supressão de ksga resulta em uma taxa de tradução da linha de base mais elevada, que seja mais resistente à modulação pelo Kasugamycin. As barras indicam os valores médios, com desvio padrão como erro. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : Resultado representativo de usar o repórter de nluc-GFP que mede a taxa do tradução na presença de Kasugamycin. Taxas de desconfiança relativas de aspartato para aspartato no tipo selvagem M. smegmatis como medido pelo repórter nluc/GFP, após o tratamento com kasugamicina (KSG) durante a noite (16 h). As barras indicam os valores médios, com desvio padrão como erro. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo descrito aqui pode ser adaptado para a medida de taxas de tradução em uma grande variedade de organismos. Há uma série de considerações que devem ser mantidas em mente ao adaptar o protocolo a outros sistemas. Primeiramente, a finalidade da medida deve ser considerada. Para a medição exata das taxas de desconfiança usando repórteres de ganho de função, o que é necessário é (a) um ensaio de leitura robusto (por exemplo, função enzimática [neste caso, atividade de luciferase] com uma ampla faixa linear). Também, procure (b) uma perda de mutação de função em um resíduo crítico da proteína do repórter que resulte em uma perda muito significativa da função, abaixo da taxa esperada de mistranslation. Por exemplo, se a taxa de desconfiança esperada a ser medida for aproximadamente 10-3/Codon, a perda de mutação de função precisa ser maior do que 1.000 vezes; caso contrário, o intervalo mais baixo de eventos de tradução não será detectado sensivelmente. Por último, para a medição exata das taxas de desconfiança usando repórteres de ganho de função, (c) é necessário um repórter de benchmark robusto-neste caso, luciferase Firefly para a seção 1 do protocolo. Idealmente, o repórter de referência deve ser fundido com o repórter enzimático mutado, garantindo (para todos os efeitos) que ambos são expressos em proporções equimolares. A leitura da referência (e do repórter preliminar) deve ser robusta às perturbações aos ambientes expostos. Por exemplo, a fluorescência do GFP de tipo selvagem é altamente suscetível à perturbação por alterações no pH28, tornando-a inadequada como referência para a mensuração das taxas de desconfiança em micobactérias fagocitadas em macrófagos, que residem em fagossomos que estão abaixo de pH 729. Por outro lado, para aplicações como a triagem de pequenas moléculas, as considerações mais importantes para uma tela primária será a reprodutibilidade das medições (ou seja, precisão, em oposição à precisão), a minimização do manuseio manual, e pequenas volumes de cultura. As medidas exatas das taxas de tradução são menos importantes e podem ser executadas como ensaios secundários. Finalmente, deve-se notar que os repórteres descritos neste protocolo, com base na função enzimática de enzimas luciferase, só irá medir as taxas de desconfiança média de uma população bacteriana, mas não pode dar informações sobre a heterogeneidade de célula única variação das taxas de desconfiança. Dada a importância da variabilidade de célula única em fenótipos adaptativos30,31,32, repórteres fluorescentes para a mensuração de eventos de tradução foram desenvolvidos12,33 , incluindo para a medida de tradução em micobactérias5.

Tendo considerado as exigências para a medida do tradução, deve-se notar que os repórteres do ganho–função genético tais como descritos neste protocolo podem somente medir um tipo de tradução (isto é, uma substituição do amino-ácido para um Codon) por repórter. Portanto, para a medição de diferentes eventos de desconfiança, vários repórteres são necessários. Por exemplo, para a mensuração da desconfiança por erros de decodificação ribossômica de códons quase cognatos por lysyl-tRNA em uma posição, pelo menos 16 repórteres são necessários2,3,11. A espectrometria de massas de alta precisão e a bioinformática permitem a identificação potencial de muitos tipos diferentes de eventos de tradução simultânea18; no entanto, esses métodos também vêm com ressalvas. Em geral, eles são menos precisos do que os repórteres de ganho de função. Além disso, como afirmado anteriormente, eles são menos adequados para a detecção de certos tipos de desconfiança, ou seja, aqueles que poderiam ser confundeados com desamidação não enzimática23. Finalmente, a espectrometria de massas não é adequada como uma leitura para triagem de média ou alta taxa de transferência.

Para a adaptação desses repórteres e protocolos para a medição da desconfiança em outros sistemas, considerações adicionais incluem uma expressão robusta do repórter no sistema de modelo desejado. Inicialmente, tentamos usar o sistema dual-luciferase desenvolvido por Farabaugh e colegas em nosso sistema Micobacteriano sem modificações, mas não teve sucesso, devido à falta de expressão de repórter. A solução de problemas extensiva identificou que a optimização do Codon e uma modificação pequena da seqüência dos repórteres foram exigidas para permitir a expressão robusta25 (e veja acima). É concebível que adaptações semelhantes dos repórteres seriam necessárias para uso em outros sistemas.

Finalmente, deve-se considerar o tipo de evento de desconfiança que está sendo medido. Por exemplo, se há uma necessidade de medir a readthrough do batente-Codon (supressão do absurdo), a perda do Codon da parada da mutação da função precisa de ser introduzida dentro de uma região não críticos da proteína preliminar do repórter34. Caso contrário, apenas eventos de supressão de absurdo específicos que recuperam o resíduo crítico (e, portanto, função de repórter) serão medidos pelo ensaio, o que potencialmente levaria a uma subestimativa substancial das taxas de verdadeira desconfiança. Há cada vez mais evidências de que o erro translacional desempenha um possível papel adaptativo em um grande número de organismos1,12,13,35. No entanto, a mensuração dos eventos de desconfiança ainda é limitada a um número pequeno, embora crescente de espécies modelo. A adaptação de métodos sensíveis para medir a desconfiança tem o potencial de aumentar ainda mais a compreensão dos cientistas sobre o papel do erro de tradução em fisiologia e patologia.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi em parte apoiado por subvenções da Fundação Bill e Melinda Gates (OPP1109789), a Fundação Nacional de ciência natural da China (31570129), e os fundos de start-up da faculdade de medicina da Universidade de Tsinghua para BJ BJ é um Wellcome Trust Investigador (207487/Z/17/Z).

Materials

Middlebrook 7H9 BD Difco 271310
anhydrotetracycline Cayman Chemical  10009542
kasugamycin sigma K4013
Dual-luciferase reporter assay system promega E1960
Nano-Glo luciferase assay promega N1120
Fluoroskan Ascent FL luminometer Thermo /
Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid Costar 3922
Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid Costar 3925
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid Costar 3599
Non-commercial reagents (plasmids)
pUV-TetOR-RenFF NA NA episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter
pUV-TetOR-Ren-D120N-FF dual-luciferase reporter with mutated Renilla
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N NA NA episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase
pMC1S-GFP NA NA Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. Protein mistranslation: friend or foe. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).
  2. Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
  3. Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
  4. Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
  5. Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).
  6. Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
  7. Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
  8. Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
  9. Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
  10. Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
  11. Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
  12. Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
  13. Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).
  14. Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
  15. Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
  16. Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
  17. Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
  18. Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
  19. Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
  20. Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
  21. Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
  22. Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
  23. Robinson, N. E., Robinson, A. B. Deamidation of human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12409-12413 (2001).
  24. Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
  25. Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
  26. Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
  27. Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
  28. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166 (2016).
  29. Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).
  30. Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
  31. Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
  32. Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).
  33. Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
  34. Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
  35. Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).

Tags

MycobacteriumMistranslation RatesGain-of-function ReporterNluc/GFP AssayAntibiotic ToleranceProtein Synthesis Errors7H9 MediumOD 600ATCKsgPassive Lysis BufferFirefly SubstrateRenilla SubstrateLuminometer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Chen, Y., Pan, M., Chen, Y., Javid, B. Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems. J. Vis. Exp. (146), e59453, doi:10.3791/59453 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image