تعزيز تطعيم خلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان عن طريق تثبيط عابر لنشاط رو كيناز
Summary
في هذا البروتوكول، نقوم بشرح وتفصيل كيفية استخدام الخلايا الجذعية متعددة القوى التي يسببها الإنسان للتمايز وتنقية خلايا القلب، والمزيد، حول كيفية تحسين كفاءتها في زرع مع مثبطات كيناز البروتين المرتبطة بـ Rho المعالجة المسبقة في نموذج احتشاء عضلة القلب الماوس.
Abstract
عامل حاسم في تحسين فعالية العلاج الخلوي لتجديد عضلة القلب هو زيادة بأمان وكفاءة معدل تطعيم الخلايا. Y-27632 هو مثبط قوي للغاية من الكينا البروتين المرتبطة بـ Rho، واللفائف المحتوية على لفائف (RhoA/ROCK) ويستخدم لمنع المبرمج الخلوي الناجم عن التفكك (anoikis). نثبت أن المعالجة المسبقة Y-27632 لخلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى (hiPSC-CMs+RI)قبل زرع نتائج في تحسين معدل تطعيم الخلايا في نموذج الماوس من احتشاء عضلة القلب الحاد (MI). هنا، نقوم بوصف إجراء كامل من التمايز hiPSC-CMs، وتنقية، والعلاج المسبق للخلايا مع Y-27632، فضلا عن تقلص الخلايا الناتجة، قياسات عابرة الكالسيوم، وزرع في نماذج MI الماوس. توفر الطريقة المقترحة طريقة بسيطة وآمنة وفعالة ومنخفضة التكلفة مما يزيد بشكل كبير من معدل تطعيم الخلايا. لا يمكن استخدام هذه الطريقة فقط جنبا إلى جنب مع طرق أخرى لزيادة تعزيز كفاءة زرع الخلايا ولكن أيضا يوفر أساسا مواتيا لدراسة آليات أمراض القلب الأخرى.
Introduction
وقد أظهرت العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية إمكانات كبيرة كعلاج لتلف القلب الناجم عن MI1. استخدام hiPSCs المتمايزة يوفر مصدرا لا ينضب من hiPSC-CMs2 ويفتح الباب أمام التطور السريع للعلاجات اختراق. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من القيود على الترجمة العلاجية، بما في ذلك التحدي المتمثل في انخفاض معدل تطعيم الخلايا المزروعة بشكل حاد.
فصل الخلايا مع التربسين يبدأ anoikis3، والتي يتم تسريعها فقط مرة واحدة يتم حقن هذه الخلايا في بيئات قاسية مثل عضلة القلب الإقفارية ، حيث البيئة نقص الأكسجة يسرع المسار نحو موت الخلايا. من الخلايا المتبقية، يتم غسل نسبة كبيرة من موقع الزرع في مجرى الدم وتنتشر في جميع أنحاء المحيط. واحدة من المسارات المبرمج ة الرئيسية هو مسار RhoA / ROCK4. استنادا إلى البحوث السابقة، ومسار RhoA / ROCK ينظم منظمة الأكتين الخلوية الهيكلية5،6، وهو المسؤول عن خلل الخلية7،8. يستخدم مثبطات ROCK Y-27632 على نطاق واسع خلال انفصال الخلايا الجسدية والجذعية وتمريرها، لزيادة التصاق الخلايا والحد من المبرمج للخلايا9و10و11. في هذه الدراسة، يستخدم Y-27632 لعلاج hiPSC-CMs قبل زرع في محاولة لزيادة معدل تطعيم الخلايا.
وقد تم إنشاء عدة طرق تهدف إلى تحسين معدل تطعيم الخلايا، مثل الصدمة الحرارية والطابق السفلي طلاء مصفوفة غشاء12. وبصرف النظر عن هذه الأساليب، يمكن للتكنولوجيا الوراثية أيضا تعزيز انتشار خلايا القلب13 أو عكس الخلايا غير المريمية في خلايا القلب14. من منظور الهندسة الحيوية، يتم زرع خلايا القلب على سقالة المواد الحيوية لتحسين كفاءة زرع15. ومما يؤسف له أن غالبية هذه الأساليب معقدة ومكلفة. على العكس من ذلك، فإن الطريقة المقترحة هنا بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وفعالة، ويمكن استخدامها كعلاج القاعدية قبل زرع، وكذلك في الاقتران مع التكنولوجيات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشمل الخطوات الرئيسية لهذه الدراسة الحصول على hiPSC-CMs نقية، وتحسين نشاط hiPSC-CMs من خلال Y-27632 المعالجة المسبقة، وأخيرا، زرع كمية دقيقة من hiPSC-CMs في نموذج MI الماوس.
وكانت القضايا الرئيسية التي تم تناولها هنا هي أننا، أولاً، قمنا بتحسين أساليب التنقية الخالية من الجلوكوز…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفان الدكتور جوزيف وو (جامعة ستانفورد) على التكرم بتقديم بناء شركة Fluc-GFP والدكتور يانوين ليو على المساعدة التقنية الممتازة. ويدعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1 المنح HL95077، HL114120، HL131017، HL138023، UO1 HL134764 (إلى J.Z.)، وHL121206A1 (إلى L.Z.)، وR56 منحة HL142627 (إلى W.Z.)، وهو جمعية القلب الأمريكية منحة العالم 16SDG30410018، وجامعة ألاباما في برمنغهام كلية منحة التنمية (إلى W.Z.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
