Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia

Las imágenes espectrales se pueden realizar de diversas maneras y se hace referencia a varios términos^1,2,3,4. En general, las imágenes espectrales se refieren a datos adquiridos en al menos dos dimensiones espaciales y una dimensión espectral. Las imágenes multiespectrales e hiperespectrales se distinguen con mayor frecuencia por el número de bandas de longitud de onda o si las bandas espectrales son contiguas¹. Para esta aplicación, los datos hiperespectrales se definen como datos espectrales adquiridos con bandas de longitud de onda contiguas alcanzadas por el espaciado de longitudes de onda centrales no menos de la mitad de la anchura completa a la mitad máxima (FWHM) de cada filtro de paso de banda utilizado para la excitación (es decir, 5 nm espaciado de longitud de onda central para filtros de paso de banda con anchos de banda de 14-20 nm). La naturaleza contigua de las bandas de datos permite un sobremuestreo del conjunto de datos, asegurando que se cumplan los criterios de Nyquist al muestrear el dominio espectral.

Las imágenes hiperespectrales fueron desarrolladas por la NASA en las décadasde 1970 y 1980 en conjunto con el primer satélite Landsat 5,^6. La recopilación de datos de varias bandas espectrales contiguas permitió la generación de un espectro de resplandor de cada píxel. La identificación y definición del espectro de resplandor de componentes individuales permitió no sólo detectar materiales superficiales por sus espectros característicos, sino que también permitió la eliminación de señales intervinientes, como variaciones en la señal debido a condiciones atmosféricas. El concepto de detección de materiales utilizando sus espectros característicos se aplicó a los sistemas biológicos en 1996, cuando Schrock et al. utilizaron combinaciones de cinco fluoróforos diferentes y sus espectros conocidos para distinguir los cromosomas etiquetados en un proceso denominado cariotipado espectral⁷. Esta técnica fue elaborada en 2000 por Tsurui et al. para la toma de imágenes de fluorescencia de muestras de tejido, utilizando siete colorantes fluorescentes y descomposición de valor singular para lograr la separación espectral de cada píxel en combinaciones lineales de espectros en la referencia biblioteca⁸. Al igual que sus contrapartes de teledetección, la contribución de cada fluoróforo conocido se puede calcular a partir de la imagen hiperespectral, dada la información a priori del espectro de cada fluoróforo.

También se han utilizado imágeneshiperespectrales en las áreas de agricultura 9, astronomía^10,biomedicina¹¹, imágenes químicas^12,aplicaciones ambientales^13,atención ocular¹⁴, ciencia de los alimentos¹⁵, ciencias forenses^16,17, ciencias médicas¹⁸, mineralogía^19,y vigilancia²⁰. Una limitación clave de los sistemas de imágenes hiperespectrales del microscopio de fluorescencia actual es que la tecnología de imágenes hiperespectrales estándar aísla las señales de fluorescencia en bandas estrechas por 1) primero filtrando la luz de excitación para controlar la excitación de la muestra, luego 2) filtrado adicional de la luz emitida para separar la emisión de fluorescencia en bandas estrechas que más tarde se pueden separar matemáticamente²¹. Filtrar tanto la iluminación de excitación como la fluorescencia emitida reduce la cantidad de señal disponible, lo que reduce la relación señal-ruido y requiere largos tiempos de adquisición. La señal baja y los largos tiempos de adquisición limitan la aplicabilidad de las imágenes hiperespectrales como herramienta de diagnóstico.

Se ha desarrollado una modalidad de imagen que hace uso de imágenes hiperespectrales pero potencia la señal disponible, reduciendo así el tiempo de adquisición necesario^21,22. Esta nueva modalidad, llamada imagen hiperespectral de análisis de excitación, adquiere datos de imágenes espectrales variando la longitud de onda de excitación y recopilando una amplia gama de luz emitida. Se ha demostrado anteriormente que esta técnica produce órdenes de aumentos de magnitud en la relación señal-ruido en comparación con las técnicas de escaneo de emisiones^21,22. El aumento de la relación señal-ruido se debe en gran medida al paso de banda ancho (600 nm) de luz de emisión detectada, mientras que la especificidad se proporciona filtrando sólo la luz de excitación en lugar de la emisión de fluorescencia. Esto permite que todas las luzs emitidas (para cada longitud de onda de excitación) lleguen al detector^21. Además, esta técnica se puede utilizar para discriminar la autofluorescencia de etiquetas exógenas. Además, la capacidad de reducir el tiempo de adquisición debido al aumento de la señal detectable reduce el peligro de fotoblanqueo, así como permite escaneos espectrales a una velocidad de adquisición que es aceptable para la imagen de video espectral.

El objetivo de este protocolo es servir como una guía de adquisición de datos para la microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación. Además, se incluyen descripciones que ayudan a entender la ruta de luz y el hardware. También se describe la implementación de software de código abierto para un microscopio de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación. Por último, se proporcionan descripciones sobre cómo calibrar el sistema a un estándar rastreable por NIST, ajustar la configuración de software y hardware para obtener resultados precisos y desmezclar la señal detectada en contribuciones de componentes individuales.