JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

تصف هذه الورقة طريقتين لتحديد الاستجابات الدفاعية في أرابيدوبسي ثاليانا بعد التعرض للمناضد المناعية: انفجار الأكسدة العابرة، وتثبيط نمو الشتلات.

Abstract

وقد تطورت النباتات نظام المناعة قوية لإدراك مسببات الأمراض والحماية من المرض. تصف هذه الورقة اختبارين يمكن استخدامهما لقياس قوة التنشيط المناعي في أرابيدوبسي ثاليانا بعد العلاج بجزيئات الإثارة. المقدمة أولاً هي طريقة لالتقاط الاندفاع التأكسدي السريع والديناميكي، والتي يمكن رصدها باستخدام الفحص القائم على الإنارة. الثاني هو طريقة تصف كيفية قياس تثبيط المناعة الناجمة عن نمو الشتلات. هذه البروتوكولات سريعة وموثوق بها، لا تتطلب التدريب المتخصص أو المعدات، وتستخدم على نطاق واسع لفهم الأساس الوراثي للمناعة النباتية.

Introduction

لإدراك وحماية ضد مسببات الأمراض، تطورت النباتات مستقبلات التعرف على نمط الغشاء المرتبطة (PRRs) التي تكشف عن الجزيئات الميكروبية المحفوظة خارج الخلية المعروفة باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات (MAMPs)1. ربط MAMPs إلى PRRs cognate الخاص بهم يبدأ البروتين kinase بوساطة إشارات المناعة مما أدى إلى مقاومة الأمراض واسعة الطيف2. واحدة من الاستجابات الأولى بعد تفعيل PRR هو الفوسفور وتنشيط غشاء البلازما المتكاملة انفجار الجهاز التنفسي OXIDASE التجانس (RBOH) البروتينات التي تحفز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي خارج الخلية (ROS)3 , 4.ROS تلعب دورا هاما في إنشاء مقاومة المرض، والعمل على حد سواء كرسل الثانوية لنشر إشارات المناعة وكذلك العوامل المضادة للميكروبات المباشرة5. ووصفت الملاحظة الأولى لانفجار الأكسدة المناعة باستخدام درنات البطاطا من السيرة الذاتية. وقد تم تقييم إنتاج ROS في العديد من الأنواع النباتية باستخدام أقراص ورقة7، والخلايا تعليق الثقافات8، وprotoplasts6. وصف هنا هو طريقة بسيطة لـ “إنتاج روس” الذي يُشغّل بالنمط في أقراص أوراق من أرابيدوبس ثاليانا (أرابيدوبسي).

استجابة لتصور MAMP، والبروتينات RBOH المنشطة تحفز إنتاج الجذور superoxide (O2–)، جذور الهيدروكسيل (•OH)، والأكسجين singlet (1 O2)التي يتم تحويلها إلى بيروكسيد الهيدروجين (H2O 2)في الفضاء خارج الخلية9. H2O2 يمكن قياسها كميا ً بواسطة اللوميلومينسين القائم على الإنارة في وجود البيروكسيداز الفجل عامل المؤكسدة (HRP)10. HRP أكسدة H2O2 توليد أيون هيدروكسيد (OH–) وغاز الأكسجين (O2)التي تتفاعل مع luminol لإنتاج وسيطة غير مستقرة التي تطلق فوتون من الضوء10. ويمكن قياس انبعاث الفوتون كمياً كوحدات ضوئية نسبية (RLUs) باستخدام قارئ لوحة صغيرة أو صور قادرة على الكشف عن الإنارة، التي أصبحت قطعاً قياسية من المعدات في معظم المختبرات الجزيئية. من خلال قياس الضوء الناتج على مدى فترة 40-60 دقيقة، يمكن الكشف عن انفجار الأكسدة عابرة في وقت مبكر 2-5 دقائق بعد العلاج المنتقد، وبلغت ذروتها في 10-20 دقيقة، والعودة إلى مستويات القاعدية بعد ~ 60 دقيقة11. يمكن استخدام الضوء التراكمي المنتج على مدى هذا الوقت بالطبع كمقياس للقوة المناعية المقابلة لتنشيط البروتينات RBOH12. مريح، هذا الاختبار لا يتطلب معدات متخصصة أو إعداد عينة مرهقة.

بلغت ذروتها بعد وقت قصير من الكشف MAMP، ويعتبر انفجار الأكسدةاستجابة المناعة في وقت مبكر، جنبا إلى جنب مع تفعيل MAPK وإنتاج الإيثيلين 5. وتشمل الاستجابات المناعية في وقت لاحق إعادة برمجة النسخ، وإغلاق stomatal، وترسب الكالوز2،5. التعرض لفترات طويلة لMAMPs ينشط باستمرار إشارات المناعة بنشاط مكلفة مما أدى إلى تثبيط نمو النبات، مما يدل على المفاضلة بين التنمية والحصانة13. يستخدم على نطاق واسع تثبيط نمو الشتلات التي تسببها نمط (SGI) لتقييم الناتج المناعي في Arabidopsis وكان جزءا لا يتجزأ من تحديد العديد من المكونات الرئيسية للإشارات المناعية بما في ذلك PRRs14،15 ،16. لذلك، تقدم هذه الورقة بالإضافة إلى ذلك بحثاً عن SGI التي يتم تشغيلها على النمط في أرابيدوبسي،حيث يتم زراعة الشتلات في لوحات متعددة الآبار تحتوي على وسائل إعلام قياسية أو وسائل إعلام مُستكملة بمُرّخ مناعي لمدة 8-12 يومًا ثم تزن باستخدام مقياس تحليلي.

ولبيان كيفية استخدام اختباري ROS وSGI لرصد الإشارات التي يتم التوسط فيها بوساطة PRR، تم اختيار ثلاثة أنماط جينية تمثل نواتج مناعية مختلفة: (1) انضمام نوع عربيدوبسي البري كولومبيا (Col-0)، (2) bak1-5 السلبي المهيمن متحولة فيها متعددة الوظائف PRR المشارك مستقبلات BRASSINOSTEROID غير حساسة 1-المرتبطة KINASE 1 (BAK1) غير وظيفية في إشارات المناعة17،18،و (3) cpk28-1 متحولة متنحية، والتي تفتقر إلى البروتين التنظيمي الذي يعتمد على الكالسيوم KINASE 28 (CPK28) ويعرض الاستجابات المناعية المرتفعة19،20. يتم تقديم الاختبارات ROS وSGI استجابة لepitope الببتيد elf18 المنتجة صناعيا من عامل استطالة البكتيرية تو (EF-Tu)، المعترف بها في Arabidopsis من قبل مستقبلات EF-Tu PRR (EFR)15. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات مع المحفزات المناعية الأخرى مثل بروتين الحركة البكتيرية فلانيلين14 أو البروتينات النباتية الذاتية (AtPeps)16، ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن استجابة النبات تختلف اعتمادا على 21. ويمكن استخدام الاختبارات التي أجرتها ROS وSGI معاً من أجل التقييم السريع والكمي للاستجابات المبكرة والمتأخرة التي يتم الاستجابة بوساطة PRR.

Protocol

1. الكشف عن انفجار ROS في أقراص أوراق أرابيدوبسي بعد استثارة المناعة نمو المصنع وصيانته. لمزامنة الإنبات، يتم تقسيم بذور أرابيدوبوبس إلى الدرجة المتوسطة عن طريق تعليق حوالي 50 بذور في 1 مل من أجار معقم بنسبة 0.1% [ث/v] وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية (بدون ضوء) لمدة 3-4 أيام.<b…

Representative Results

متحولة cpk28-119،25 وbak1-517،تم استخدام18 النباتات لإظهار النتائج المتوقعة للأنماط الجينية مع استجابات المناعة العالية والمنخفضة، على التوالي، في انفجار الأكسدة وSGI الاختبارات نسبة إلى عنصر تحكم خلفية م…

Discussion

تصف هذه الورقة طريقتين لـ “الاستجابات المناعية التي يتم تشغيلها بالنمط” في “أرابيدوبسي”،وتقدم نُهجاً كمية لتقييم الناتج المناعي دون استخدام معدات متخصصة. في تركيبة، يمكن استخدام ROS وSGI التي يتم تشغيلها نمط لتقييم الاستجابات المبكرة والمتأخرة لتصور الميكروبات، على التوالي.

<p class="jove_…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يتم تمويل العمل في مختبرنا من خلال برنامج اكتشاف مجلس الموارد الطبيعية والبحوث الهندسية الكندية (NSERC)، والصندوق الكندي للابتكار جون ر. إيفانز زعيم، وجامعة الملكة. يتم دعم KS وIS من خلال منح دراسية للخريجين في أونتاريو جنبا إلى جنب والمنح الدراسية للخريجين في كندا NSERC لطلاب الماجستير (CGS-M).

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops – production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).

Tags

Arabidopsis ThalianaPattern-triggeredOxidative BurstSeedling Growth InhibitionImmune OutputsPlant GenotypesLaboratory EquipmentLeaf DiscsElicitorsReactive Oxygen SpeciesMicroplate ReaderMS MediumSeedling GrowthGrowth Inhibition

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image