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Immunologie et infection

Traitement du liquide de lavage bronchoalvéolaire et du sang apparié pour le macrophage alvéolaire et le CD4- Immunophénotypage à cellules T et évaluation du réservoir du VIH

Published: June 23, 2019
doi:
10.3791/59427
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1Research Institute McGill University Health Centre, 2Department of Biological Sciences,Université de Québec à Montréal, 3Department of Microbiology & Immunology,McGill University, 4Department of Medicine, Division of Infectious Diseases,McGill University, 5Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal, 6Département de microbiologie, infectiologie et immunologie,Université de Montréal

Summary

Nous décrivons une méthode pour traiter le liquide de lavage bronchoalveolar et le sang périphérique assorti des individus chroniquement HIV-infectés sur la thérapie antirétrovirale pour évaluer les réservoirs pulmonaires de HIV. Ces méthodes ont comme conséquence l’acquisition des cellules T cD4 très pures et des macrophages alvéolaires qui peuvent plus tard être employés pour l’immunophénotypage et les quantifications d’ADN/ARN de HIV par réaction en chaîne ultrasensible de polymérase.

Abstract

La bronchoscopie est une procédure médicale par le fait que la saline normale est injectée dans les poumons par l’intermédiaire d’un bronchoscope, puis l’aspiration est appliquée, en levant le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BAL). Le fluide BAL est riche en cellules et peut ainsi fournir un «instantané» du milieu immunitaire pulmonaire. Les lymphocytes T CD4 sont les réservoirs de VIH les mieux caractérisés, tandis qu’il existe des preuves solides qui suggèrent que les macrophages tissulaires, y compris les macrophages alvéolaires (AM), servent également de réservoirs viraux. Cependant, on ignore encore beaucoup de choses sur le rôle des MA dans le contexte de l’établissement et de l’entretien des réservoirs de VIH. Par conséquent, l’élaboration d’un protocole de traitement du liquide BAL pour obtenir des cellules qui peuvent être utilisées dans des essais virologiques et immunologiques pour caractériser et évaluer les populations cellulaires et les sous-ensembles dans le poumon est pertinente pour comprendre le rôle des poumons en tant que VIH Réservoirs. Ici, nous décrivons un tel protocole, employant des techniques standard telles que la centrifugation simple et la cytométrie de flux. Les lymphocytes T CD4 et les AM peuvent ensuite être utilisés pour des applications ultérieures, y compris l’immunophénotypage et la quantification de l’ADN et de l’ARN du VIH.

Introduction

L’un des défis les plus importants auxquels est confronté un remède à l’infection par le VIH est la présence du réservoir latent du VIH qui provoque un rebond de la virémie plasmatique à la suite de l’interruption du traitement antirétroviral (TAR)1,2. Bien que le réservoir du VIH pendant la multithérapie à long terme soit bien documenté dans plusieurs compartiments tissulaires, y compris les organes lymphoïdes secondaires, les tissus lymphoïdes associés à l’intestin (TNA) et le système nerveux central (SNC), les poumons ont été négligés comme zone d’étude. depuis l’ère pré-ART3. Cependant, les poumons jouent un rôle central dans la pathogénie du VIH. En effet, les symptômes pulmonaires ont été parmi les premiers indicateurs d’infections opportunistes liées au sida4. Même à l’ère moderne de la multithérapie, les personnes vivant avec le VIH courent un plus grand risque de développer des maladies pulmonaires infectieuses et non infectieuses que les personnes non vivant avec le VIH. Par exemple, les personnes infectées par le VIH courent un risque élevé d’infection invasive à la pneumonie streptococcique, ainsi que de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)5,6. En outre, la coinfection de la tuberculose (TB) et du VIH est un défi de santé publique important dans certaines régions du monde, notamment en Afrique subsaharienne, car les personnes infectées par le VIH sont 16 à 27 fois plus susceptibles d’avoir la tuberculose que les personnes non séropositives7. Bien que quelques explications de cette susceptibilité à l’infection pulmonaire et aux maladies chroniques aient été proposées8,9,10, les mécanismes cellulaires précis par lesquels les personnes ayant supprimé le VIH La charge virale de plasma reste à un plus grand risque pour des complications pulmonaires n’ont pas été entièrement élucidées. Fait important, le VIH est un facteur de risque très élevé d’infection pulmonaire et de maladie chronique, indépendamment du statut de fumeur6.

L’analyse de l’environnement immunitaire du poumon est donc cruciale pour comprendre son rôle dans la santé et la maladie. Bien que non invasifs, les échantillons induits d’escmiseont tendent à contenir de grandes quantités de cellules épithéliales et de débris avec les lymphocytes pulmonaires rares et aucun AMs, limitant leur rôle aux applications spécifiques. Inversement, de grandes biopsies de tissu ne peuvent pas être obtenues en l’absence de la maladie suspectée due aux risques associés de saignement significatif et de pneumothorax (effondrement du poumon). En outre, la majorité des cellules immunitaires pulmonaires sont principalement situées au niveau muqueux où les poumons sont continuellement stimulés par des antigènes pendant la respiration. À cette fin, la bronchoscopie pour obtenir du liquide BAL a l’avantage d’offrir un accès relativement sécuritaire aux lymphocytes et aux MA (voir la figure 1). Les macrophages constituent la plus grande proportion de cellules dans le liquide BAL, suivies par les lymphocytes11. Il est donc utile d’établir une méthode par laquelle le fluide BAL peut être traité pour une utilisation dans des applications ultérieures, telles que l’immunophénotypage, la culture cellulaire, la transcriptomique, ou toute autre application. Le protocole de traitement du fluide BAL décrit ici est adapté des procédures générales précédemment décrites et optimisées pour les divers essais en aval utilisés. Cette méthodologie permet l’isolement des lymphoïdes pulmonaires et des cellules immunitaires muqueuses myéloïdes pour leur caractérisation phénotypique et fonctionnelle, ainsi qu’une évaluation du réservoir du VIH chez les adultes vivant avec le VIH.

Pour établir ce protocole, nous avons utilisé les critères suivants pour recruter les participants à l’étude15. Pour que les participants soient admissibles à participer à cette étude, il fallait qu’il s’agisse de personnes infectées par le VIH qui satisfaisaient aux critères suivants : (1) sous multithérapie pendant au moins 3 ans; (2) charge virale supprimée (VL) pendant au moins 3 ans; (3) Nombre de lymphocytes T CD4 de 200/mm3; (4) prêt à subir une spirométrie de recherche et une bronchoscopie. Les patients ayant les critères suivants ont été exclus de l’étude : (1) contre-indication(s) à la bronchoscopie; (2) risque élevé de saignement : coagulopathie ou traitement de la warfarine ou du clopidogrel; (3) thrombocytopenia (faibles plaquettes); (4) infection pulmonaire active ou un autre processus pulmonique aigu; (5) enceinte/essayer de devenir enceinte.

Protocol

Ce protocole de recherche a été établi directement sur la base des principes inclus dans la Déclaration d’Helsinki et a reçu l’approbation des commissions d’examen institutionnels du Centre universitaire de santé McGill (IR-CUSM, #15-031), de l’Université du Québec à Montréal (UQAM, #602) et le Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CR-CHUM, #15-180). 1. Lavage Bronchoalveolar REMARQUE: Cette section décrit la bronchoscopie telle qu’elle est effectuée par un pneumologue agréé avec l’aide d’un inhalothérapeute16,17. Préparer les pièces d’appareil nécessaires à la procédure, y compris un bronchoscope et saline. Administrer un spray anesthésique à l’arrière de la gorge du patient. Évitez l’utilisation excessive de l’anesthésie topique lorsque c’est possible. Appliquer des fils cardiaques à la poitrine afin de surveiller la fréquence cardiaque et le rythme et une sonde d’oxygène au premier doigt d’une main afin de surveiller la saturation en oxygène. Insérez la canule nasale dans les narines pour fournir de l’oxygène supplémentaire. Placez le patient, de préférence en position de supine. Administrer la sédation comme suit : midazolam 0.01-0.04 mg/kg et fentanyl 50-100 g (pour faciliter le confort du patient et réduire au minimum le réflexe de toux) par voie intraveineuse, en présence d’un pneumologue ou d’un anesthésiste. Avancez le bronchoscope flexible jusqu’à ce qu’il soit coincé dans les bronches sous-segmentées désirées. Instiller la saline (50-60 ml à la fois) avec la seringue, puis appliquer l’aspiration douce (50-80 mmHg). Le liquide de lavage s’accumule dans la seringue et sera ensuite transféré dans un récipient de collecte. Répéter la chasse d’eau à un total de 200-300 ml de lavage. Recueillir au moins 100 ml de liquide BAL si possible. Placer le fluide BAL sur la glace. 2. Isolement des cellules BAL REMARQUE: La procédure suivante doit être effectuée dans des conditions stériles dans un coffret de sécurité biologique, de classe II (BSL2) ou plus. Conservez les échantillons de BAL sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient traités. Vortex le BAL dans le tube de collecte d’origine et le transférer dans un tube de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique. Si le fluide BAL semble très turbide ou contaminé par des tissus filamenteux, filtrez le liquide à travers un filtre en maille de nylon de 70 m dans un nouveau tube de 50 ml. Centrifugeuse à 200 x g pendant 10 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 50 ml. Casser délicatement la pastille à l’aide d’une pointe de pipette et la suspendre en 1 ml de milieu RPMI 1640. Transférer 1 ml du supernatant à chacun des tubes microcentrifuges de 10 x 1,5 ml et le reste du supernatant à 15 ml de tubes, 10 ml chacun. Conserver tous les tubes supernatants à -80 oC. Traiter la pastille de cellule BAL. Resuspendre la pastille dans 10 ml de RPMI 1640 pour chaque 25 ml de l’échantillon original. Centrifugeuse à 200 x g pendant 10 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 15 ml (jeter après s’être assuré qu’il y a suffisamment de cellules dans la pastille). Resuspendre la pastille dans 1 ml de RPMI 1640 – 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et compter à l’aide de trypan bleu et d’un hémocytomètre.REMARQUE: Si le fluide BAL n’est pas séparé par l’adhérence des cellules avant le tri, passez à l’article 4. 3. Adhérence des cellules BAL (facultatif) REMARQUE: Ce protocole alternatif peut être exécuté avant ou au lieu du tri cellulaire. La procédure suivante doit être effectuée dans des conditions stériles dans un cabinet BSL2 (ou plus). Transférer le nombre désiré de cellules BAL pour le tri dans un nouveau tube de 15 ml et constituer le volume correct pour 1,5 x 106 macrophages/mL. Plaque 2 ml de cellules par puits dans des plaques de 6 puits etincuber pendant 2 h à 37 oC avec 5 % de CO 2, pour laisser le temps à l’adhérence. Après l’incubation, aspirez soigneusement le support contenant des cellules non adhérentes et transférez-le dans un tube de 15 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Retirez le supernatant et resuspendez à 1 x 107 cellules/mL dans la saline tamponnée en phosphate (PBS) et transférez la suspension dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 ml. Cette fraction de lymphocyte est maintenant prête à tacher pour le tri cellulaire. Pour les autres cellules adhérentes dans la plaque, ajouter 1 ml par puits de solution de dissociation cellulaire (voir le tableau des matériaux) et couver pendant au moins 15 min à 37 oC avec 5 % de CO2,jusqu’à ce que les cellules se séparent facilement de la plaque avec une pointe de pipette. Gratter délicatement mais complètement les cellules adhérentes de la surface du puits à l’aide d’une pointe de pipette, et utiliser 1 ml de liquide dans le puits pour aider au détachement. Transférer les cellules dans un nouveau tube de 15 ml. Laver les puits avec 1 ml de PBS et l’ajouter au même tube. Faire le contenu du tube à 5 ml avec PBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à RT. Retirez le supernatant, suspendez-le à 1 x 107 cellules/mL PBS – 2 % FBS, et transférez la suspension dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 ml. Cette fraction myéloïde est maintenant prête à tacher pour le tri cellulaire. 4. Isolement des cellules mononucléaires périphériques de sang REMARQUE: La procédure suivante doit être effectuée dans des conditions stériles dans un cabinet BSL2 (ou plus). Le même jour de la bronchoscopie (généralement directement avant la collecte BAL), obtenir six tubes de sang veineux d’un donneur dans des tubes d’acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) (environ 10 ml par tube). Séparer le sang en centrifugeant les tubes sanguins à 300 x g pendant 15 min à RT. Transférer le plasma à 1,5 ml de tubes microcentrifugeurs dans 1 ml d’aliquots et le stocker à -80 oC. Effectuer la séparation du gradient de densité. Ajouter 2 mL de RPMI 1640 à chaque tube sanguin et bien mélanger à l’aide d’une pipette sérologique. Transférer dans des tubes de 3x 50 ml et faire le volume de chaque tube à 25 ml avec RPMI 1640. Préparer un autre lot de tubes de 3x 50 ml, contenant chacun 20 ml de milieu de séparation des lymphocytes (LSM) (voir le tableau des matériaux)à RT. Couchez lentement et doucement les 25 ml de sang dilué sur le LSM pour chacun des trois tubes, en maintenant le tube à un angle de 45 degrés . Centrifugeuse à 600 x g pendant 25 min à RT avec une faible accélération et sans décélération (frein). Effectuer un lavage des cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC). Transférer la couche de cellules à l’interface des deux phases liquides du tube dans un tube de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique; s’il y a plus de 30 ml de volume, divisez-le en deux tubes. Faire le volume dans chaque tube à 50 ml avec PBS. Centrifugeuse à 700 x g pendant 5 min à RT et retirer autant de supernatant que possible. Resuspendre la pastille et faire passer le volume à 25 ml avec PBS. Centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à RT et retirer autant de supernatant que possible. Répétez l’étape de lavage décrite à l’étape 4.4.3. Resuspendre la pastille en 5 ml de PBS et 2% de FBS et compter les cellules. 5. Trier les cellules BAL entières et les PBMC REMARQUE: La procédure suivante doit être effectuée dans des conditions stériles dans un BSL2 (ou plus). Préparer un tampon de tri contenant du PBS à 5 % FBS et 25 mM HEPES (pH 7,4). Préparer 5 mL de tubes en polystyrène à fond rond avec 1 ml de FBS pour la collecte de sous-ensembles cellulaires triés. Effectuer la coloration. Préparer des tubes de polystyrène à fond rond de 3 x 5 ml, chacun pour le BAL (cellules entières ou lymphocytes et fractions myéloïdes après l’observance) et les PBMC (voir la section 4). Pour chaque sous-ensemble, préparer un tube avec des cellules à trier et deux tubes de 5 x 105 cellules à utiliser pour les contrôles non tachés et de viabilité de compensation des taches. Centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirez les supernatants, suspendez les cellules pour les contrôles dans 100 OL de PBS, et stockez-les à 4 oC jusqu’à ce que les contrôles de compensation puissent être préparés comme décrit à l’étape 5.2.6. Préparer une dilution 1:20 du récepteur Fc (FcR) bloquant le réactif dans PBS – 5% FBS (voir le tableau des matériaux- pour empêcher la liaison non spécifique de l’anticorps à FcR sur les cellules exprimant Le FcR). Resuspendre les cellules pour les trier à 1 x 107 cellules dans 250 ‘L de mélange FcR-blocage. Incuber pendant 1 h à 4 oC. Après l’incubation, ajouter le cocktail d’anticorps approprié (voir tableau 1) aux cellules et couver pendant 1 h à 4 oC dans l’obscurité. Après 1 h de coloration, ajouter 1 ml de PBS aux cellules et centrifugeuseà 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirez le supernatant et resuspendez les cellules dans un tampon de tri pour avoir 1 x 107 cellules dans 250 L. Filtrer les cellules à travers un filtre de 70 m si nécessaire. Préparer les contrôles de compensation. Ajouter trois gouttes chacune d’Ig anti-souris, de perles de compensation de contrôle négatif (voir le Tableau des matériaux) par 1 ml de PBS dans un tube de microcentrifuge et transférer 100 L à chaque tube de polystyrène à fond rond de 5 ml à utiliser pour être indemnisé. Préparer un tube pour chaque fluorochrome présent dans le cocktail à utiliser. Ajouter 1 l de chaque anticorps dans le cocktail à un tube différent contenant des perles. Ajouter 1 ll de tache de viabilité à l’un des tubes de 5 x 105 cellules mises de côté à l’étape 5.2.1. Incuber pendant 20 min à 4 oC dans l’obscurité. Ajouter 1 ml de PBS à chaque tube et centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirez le supernatant et suspendez la pastille dans 250 L de PBS. Conserver à 4 oC dans l’obscurité jusqu’à ce que nécessaire. Trier les cellules par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) dans des tubes de collecte préparés avec 1 ml de FBS et tourbillonner doucement pour enrober les côtés des tubes avec du sérum. Trier les cellules BAL à basse pression. Les cellules de porte d’abord pour exclure le bruit et inclure les cellules vivantes, CD45, et dans cette porte de population dehors les cellules de doublet (voir la figure 3). Dans la plus grande population myéloïde tri CD206 et CD169 cellules doubles positives en tant que AMs ; au sein de la plus petite population de lymphocytes, isoler les cellules CD3 et trier les populations positives CD4 et CD8 (voir la figure 3; stratégie de gating détaillée dans la section des résultats représentatifs). Lors du tri des PBMC, les cellules de porte d’abord pour exclure le bruit et inclure les cellules vivantes, CD45, et dans cette porte de population dehors les cellules de doublet. Ensuite, porte sur les cellules CD3 et au sein du CD3- population, porte d’abord sur CD14 et trier les monocytes monopositifs, puis dans la porte de la population CD3 sur CD4 et CD8 et trier les deux populations positives uniques (stratégie de gating détaillée dans le Section des résultats représentatifs. 6. Immunophénotypage des AM et des PBMC REMARQUE: La procédure suivante doit être effectuée dans des conditions stériles dans un cabinet BSL2 (ou plus). Ajoutez jusqu’à 1 million chacun des AM et des PBMC à deux tubes de polystyrène à fond rond distincts de 5 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC et retirer le supernatant. Effectuer le blocage FcR pour améliorer la spécificité de la coloration des anticorps. Pour cela, resuspendre les cellules en 100 OL de PBS 2 % DE FBS et ajouter 1,4 L de réactif de blocage FcR. Incuber 20 min à 4 oC. Effectuer la coloration extracellulaire. Après l’incubation avec le bloc FcR, ajouter le cocktail d’anticorps extracellulaire désiré, vortex les tubes, et incuber pendant 1 h à 4 oC dans l’obscurité. Laver 2x en ajoutant 500 OL de PBS et en centrifuge à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Préparez-vous à la fixation et à la perméabilisation (voir le Tableau des matériaux pour les réactifs spécifiques utilisés). Préparer la solution de perméabilisation avec 1 tampon de perméabilisation en partie et 3 parties tampon diluant. Resuspendre la pastille dans 1 ml de solution de perméabilisation et incuber pendant 40 min à 4 oC dans l’obscurité. Préparer la solution de lavage à l’aide d’un tampon de lavage en partie et 4 parties H2O. Ajouter 2 ml de solution de lavage aux cellules perméabilisées et centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirez le supernatant. Effectuer la coloration intracellulaire. Resuspendre les cellules dans 100 oL de solution de lavage 1x, ajouter les anticorps intracellulaires désirés, vortex les tubes, et incuber pendant au moins 1 h à 4 oC dans l’obscurité. Ajouter 2 ml de solution de lavage et centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min à RT. Retirez le supernatant et suspendez la pastille dans 200 L de PBS. Conserver les cellules à 4 oC dans l’obscurité jusqu’à ce que nécessaire. 7. Reste des cellules BAL REMARQUE: La procédure suivante doit être effectuée dans des conditions stériles dans un cabinet BSL2 (ou plus). Les numéros cellulaires le permettent, cryoconservent les cellules vivantes de la pastille cellulaire BAL (à partir de l’étape 2.2.2). Préparer un support de congélation contenant 90 % de FBS et 10 % de sulfoxide de diméthyle (DMSO). Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 4 oC. Retirer le supernatant et le resuspendre dans 1,5 ml de support de congélation dans un flacon cryogénique. Transférer les flacons cryogéniques dans un récipient de congélation à taux contrôlé (voir le Tableau des matériaux)et les placer à -80 oC. Transférer les cellules à l’azote liquide pour le stockage à long terme une fois que la température est atteinte. Préserver les cellules BAL sous forme de granulés secs. Transférer les cellules restantes dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Centrifugeuse dans une centrifugeuse de comptoir à 6 000 x g pendant 1 min. Retirez le plus de supernatant possible sans déranger la pastille. Conserver la pastille à -80 oC. 8. Quantification de l’ADN et de l’ARN du VIH REMARQUE: La procédure suivante doit être effectuée dans des conditions stériles dans un cabinet BSL2 (ou plus). Quantification totale de l’ADN du VIH Pour éviter l’inhibition de la réaction en chaîne de polymérase (PCR) avec des débris de lysate BAL, utilisez un kit d’extraction d’ADN (voir le Tableau des matériaux) pour extraire l’ADN d’un échantillon de cellules BAL selon les instructions du fabricant. Utilisez 15 L de cet ADN combiné à un mélange maître dans l’étape de préamplification décrite ci-dessous (étape 8.1.3). Préparer les dilutions courbes standard. Comme ci-dessus, utilisez un kit d’extraction d’ADN pour extraire l’ADN d’une pastille de 2 x 106 cellules ACH-2 (voir le Tableau des matériaux). Après l’élution de l’ADN, effectuer des dilutions sérielles de 10 fois de l’ADN ACH-2 pour générer six dilutions, allant de 3 x 105 cellules à 3 cellules par 15 l. Effectuez une étape de préamplification. Dans une pièce séparée, préparer le mélange principal pour les échantillons de n et 2 échantillons comprenant 1 x tampon de polymérase, 3 mM de MgCl2, 300 M dNTP, et 2,5 U de polymérase d’ADN Taq (voir le tableau des matériaux) et 300 nM de chacun e des quatre amorces (voir étape 8.1.3.2). Effectuer toutes les mesures dans les puits triples. Utilisez des amorces hCD3OUT5′, hCD3OUT3′, ULF1 et UR1 pour générer de l’ADN amplifié à partir du CD3 humain et du VIH (voir les séquences du tableau 2). Notez que les deux gènes sont préamplifiés dans le même tube. Mélanger délicatement et faire tourner le tube pour assurer un mélange complet. Distribuer 35 ll de mélange maître par puits dans une plaque PCR de 96 puits et ajouter 15 L d’ADN standard ou échantillon. Le volume total de réaction est de 50 l. Effectuer la préamplification (dénaturation à 95 oC pendant 8 min, suivie de 12 cycles de 95 oC pendant 1 min, de 55 oC pour 40 s, de 72 oC pour 1 min et d’allongement à 72 oC pendant 15 min). Effectuer en temps réel PCR. Pour quantifier le CD3 et l’ADN du VIH, préparez deux mélanges principaux contenant un mix maître de réaction PCR 1x (voir le Tableau des matériaux),des amorces appropriées de 1 250 nM et une sonde de 100 nM. Utilisez les amorces HCD3IN5′ et HCD3IN3’ et sondez CD3 FamZen pour quantifier le CD3 humain en une seule réaction, et les amorces UR2 et LambdaT et sondez UHIV FamZen pour quantifier l’ADN du VIH dans une autre réaction (voir les séquences du tableau 2). Distribuer 13,6 L de chaque mélange dans des tubes qPCR-adaptés. Diluer le produit DE préamplification PCR à 1:10 dans l’eau stérile, DNase, RNase, et sans protéase. Ajouter 6,4 L de chaque échantillon dilué à 13,6 l de mélange qPCR dans des tubes adaptés au qPCR pour un volume de réaction total de 20 l. Effectuer le PCR en temps réel en utilisant le programme suivant : dénaturation à 95 oC pour 4 min et 40 cycles de 95 oC pour 3 s et 60 oC pour 10 s avec acquisition unique. Extrapolez le nombre de copies du VIH et les équivalents de cellules de nombre dans chaque tube de réaction des courbes standard. Calculer le nombre de copies d’ADN du VIH/10cellules 6. Quantification de l’ARN du VIH Extraire l’ARN d’un échantillon de cellules BAL, à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN (voir le Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. Utilisez 17 L de cet ARN dans l’étape de transcription et de préamplification inversée décrite ci-dessous (étape 8.2.4). L’ARN LTR-gag synthétisé in vitro et quantifié avec précision est utilisé comme norme; il est épilé dans l’extrait sain d’ARN de distributeur pour la normalisation de GUSB. Préparer six dilutions série1 10 fois de cette norme, correspondant à 3 x 105 cellules à trois copies de l’ARN LTR-gag dans 17 L. Distribuer 17 L de chaque dilution standard et chaque échantillon dans une plaque PCR de 96 puits et traiter les échantillons avec du DNase (voir le Tableau des matériaux)pendant 10 min à 25 oC pour éliminer l’ADN génomique contaminant. Arrêtez la réaction en ajoutant 2 ‘L de 25 mM EDTA et incubez les échantillons pendant 10 min à 65 oC. Effectuer la transcription inversée (RT) et la préamplification PCR. Effectuez cette étape à l’aide d’un kit RT-PCR en une seule étape (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. Utilisez les amorces GUSB avant 1, GUSB inverse 1, UR1 et ULF1 pour générer de l’ADNc amplifié à partir du GUSB humain en tant que gène d’entretien ménager et ARN VIH LTR-gag (voir les séquences du tableau 2). Les valeurs GUSB seront utilisées pour normaliser les valeurs du VIH. Distribuer 31 ll de mélange principal par puits dans la même plaque PCR de 96 puits contenant les normes et les échantillons traités par DNase et bien mélanger. Le volume total de réaction est de 50 l. Exécuter la plaque pendant 16 cycles selon les instructions du fabricant, avec une température d’annealing de 55 oC. Effectuer en temps réel PCR. Préparer deux mélanges principaux contenant 1x PCR reaction master mix (comme ci-dessus à l’étape 8.1.4.1), 1250 nM amorces appropriées, et 100 nM sonde. Utilisez les amorces GUSB avant 2, GUSB inverse 2, et sonde GUSB-HEX pour quantifier gusB cDNA en une seule réaction; utiliser les amorces UR2, LambdaT et sonder UHIV FamZen pour quantifier l’ADNc séropositive dans une autre réaction (voir les séquences du tableau 2). Distribuer 13,6 L de chaque mix maître dans des tubes qPCR-adaptés. Diluer les produits PCR de préamplification RT 1:10 dans de l’eau stérile, du DNase, de la RNase et de la protéase sans protéase, et ajouter 6,4 L de chaque échantillon dilué ou standard au mélange PCR approprié. Le volume total de réaction est de 20 l. Effectuer le PCR en temps réel en utilisant le programme suivant : dénaturation à 95 oC pour 4 min et 40 cycles de 95 oC pour 3 s et 60 oC pour 10 s avec acquisition unique (sélectionnez le canal vert pour FamZen et jaune pour HEX).

Representative Results

Chez la plupart des non-fumeurs, le liquide BAL est reçu dans un contenant stérile et est un liquide légèrement turbide de couleur jaune-orange. Le fluide peut être plus rose dans la couleur si le donneur a subi des biopsies endobronchiques pendant la bronchoscopie et quelques saignements se sont produits. Le liquide peut être de couleur plus foncée si le donneur est un fumeur. Après la centrifugation, le supernatant BAL sera presque clair et légèrement orange, tandis que la pastille cellulaire peut varier en couleur du blanc cassé au brun très foncé, selon l’état de l’échantillon et si le donneur était un fumeur ou non. En comptant l’ensemble de l’échantillon BAL, différents types de cellules peuvent être visualisés, y compris les macrophages plus grands et ronds d’environ 17 m de diamètre et les lymphocytes ronds plus petits d’environ 7,3 m de diamètre18,19 (voir la figure 2). Les macrophages sont agrandis chez les fumeurs d’environ 40 . La distinction entre les types de cellules permet de compter les macrophages et les lymphocytes séparément. Il peut également y avoir des débris visibles sur le terrain, en particulier dans les échantillons de fumeurs. Les macrophages sont le type de cellules le plus abondant dans le BAL, représentant environ 85% des cellules chez les non-fumeurs20, et ils sont enrichis chez les fumeurs de sorte qu’ils peuvent sembler presque exclusifs. Les cellules BAL ont tendance à s’agréger, elles doivent donc être bien mélangées lors de toutes les manipulations. La pastille peut sembler foncée même après plusieurs étapes de lavage. Si des débris filamenteux sont évidents dans la fraction après la coloration pour le tri cellulaire, passez les cellules à travers un filtre de 70 m avant de les faire passer à travers le trieur cellulaire. Le tri des cellules BAL doit être fait à basse pression pour assurer des tailles de gouttelettes assez grandes pour accueillir les macrophages. Les cellules sont d’abord fermées pour inclure toutes les cellules CD45et21, puis basées sur la viabilité pour s’assurer que toutes les cellules mortes sont exclues (voir La figure 3). Les cellules singlet sont ensuite choisies et à l’intérieur de celle-ci, deux populations sont fermées en fonction de la taille et de la morphologie, à savoir des cellules myéloïdes plus grandes et des lymphocytes plus petits (voir la figure 3). Dans les plus grandes cellules, les cellules sont fermées sur CD20622,23 et CD16922 et les cellules à double positif sont triées comme AMs, tandis que dans les cellules plus petites, les cellules CD3 sont choisies et fermées sur CD4 et CD8; Les cellules cD4 monopositives et CD8 sont triées (voir la figure 3). Les marqueurs utilisés ont été choisis sur la base de phénotypes précédemment décrits des AM, tels que le récepteur de mannose CD206, trouvé sur les cellules phagocytiques23, et le récepteur de sialoadhesin CD16922. Lors du tri des PBMC, les cellules sont d’abord fermées sur la diffusion vers l’avant et latérale qui devrait montrer une population homogène de lymphocytes, qui sont tous prises, à l’exclusion du bruit proche de l’axe zéro (données non montrées). La population est fermée sur la viabilité et CD45, et les cellules CD45vivantes sont utilisées. Cette population est alors fermée sur CD3; pour isoler les monocytes, le CD3- population est ensuite fermée sur CD14 et toutes les cellules positives simples sont triées. Pour isoler les sous-ensembles de lymphocytes, les cellules CD3sont fermées sur cD4 et CD8 et les populations positives et cellulaires uniques sont triées. Figure 1 : Aperçu du protocole. Un schéma montrant le flux de travail du protocole, y compris les utilisations potentielles en aval des échantillons générés. PBMC – cellules mononucléaires sanguines périphériques; BAL – lavage bronchoalveolar; LSM et milieu de séparation des lymphocytes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Vue de champ de microscope du fluide entier de BAL. Images de microscope de (A) un non-fumeur et (B) un fumeur avec des lymphocytes visibles (L), des macrophages (M), et des globules rouges (RBC). Le grossissement est de 1 000x (10x lentille oculaire et 100x avec immersion à l’huile). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Stratégie de gating représentative pour le tri cellulaire de cellules BAL entières. Stratégie de gating utilisée pour trier les macrophages alvéolaires (AM), CD4 et CD8 lymphocytes T à partir d’échantillons entiers de cellules BAL. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. échantillon anticorps Fluorochrome cloner Volume par test (L) BAL et PBMC Live/Dead APC-H7 (en anglais seulement) – 1 Fois CD45 (en) PE-Cy7 (en) HI30 (HI30) 5 Annonces CD3 (en) Alexa700 Alexa700 Alexa700 UCHT1 (en) 2 (en) CD4 (en) PE-cy5 (en) RPA-T4 4 ( en plus) CD8 (en) BV605 (en anglais seulement) SK1 SK1 3 (en) BAL seulement CD206 (en) Pe 19,2 10 Ans et plus CD169 (en) Le BB515 7 à 239 5 Annonces PBMC seulement CD14 (en) BV786 (en anglais seulement) M5E2 (en) 5 Annonces Tableau 1 : Panneau de débit pour le tri des cellules BAL entières et des PBMC isolés. cible pas Nom d’amorce Séquence d’apprêt VIH ADN total ou ARN LTR-Gag VIH Pré-amplification PCR UR1 (UR1) 5′-CCA TCT CTC TC TC TAG C-3′ ULF1 ULF1 5′-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3′ PCR en temps réel UR2 (UR2) 5′-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3′ LambdaT LambdaT 5′-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3′ UHIV FamZen: 5′-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3′ ADN CD3 Pré-amplification PCR HCD3 sur 5′ 5′-ACT GAC GAG GAA CAG GGG AAG-3′ HCD3 sur 3′ 5′-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3′ PCR en temps réel HCD3 en 5′ 5′-GGC TAT TCT TCT TCT TCA AGG T-3′ HCD 3 en 3′ 5′-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3′ Famzen CD3: 5′-/56-FAM/AG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3′ ARN GUSB Pré-amplification PCR GUSB Avant 1: 5′-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3′ GUSB Revers 1: 5′- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3′ PCR en temps réel GUSB Avant 2: 5′-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3′ GUSB Inversé 2: 5′- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3′ GUSB-HEX: 5′-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3′ Tableau 2 : Séquences d’apprêt et de sonde pour la quantification de l’ADN et de l’ARN du VIH.

Discussion

Ici, nous avons décrit une méthode de traitement du liquide BAL pour obtenir des lymphocytes T CD4 et des AM, aux côtés des PBMC assortis, qui peuvent être étudiés pour étudier le réservoir du VIH dans les poumons. Nous avons récemment signalé la quantification de l’ADN du VIH dans les lymphocytes T CD4 à partir d’échantillons de sang périphérique et de BAL appariés, et notre groupe a démontré que le VIH est 13 fois plus abondant dans les lymphocytes T CD4 pulmonaires que dans ceux du sang périphérique15. Cependant, les niveaux d’ADN du VIH dans les MA sont dépendants des donneurs et, jusqu’à présent, il n’y a pas eu de corrélation cohérente entre les niveaux d’ADN du VIH dans les lymphocytes par rapport aux macrophages15. L’accès à ces sous-ensembles de cellules macrophages primaires sera toutefois un outil essentiel pour interroger cette question et mieux comprendre la charge virale dans le poumon dans le contexte du réservoir du VIH.

Dans l’ère pré-ART et dans plusieurs autres études utilisant le fluide de BAL, les participants ont subila bronchoscopie afin de diagnostiquer une pathologie suspectée ou d’obtenir un diagnostic microbiologique pour des symptômes respiratoires 3. Cependant, nous avons pu recruter des participants sans aucun symptôme pulmonaire actif ou des pathologies et tous les participants ont signé un formulaire de consentement éthique15. Nous avons pu recruter des participants de notre centre qui participaient à d’autres études, comme une étude de dépistage de la spirométrie pour les maladies pulmonaires obstructives24, ainsi que ceux subissant d’autres procédures de recherche, telles que la leuphrèse et Coloscopie. Des recherches antérieures menées auprès de personnes vivant avec le VIH ont démontré que l’altruisme est un facteur clé qui motive la participation aux études de recherche25. Comme avec beaucoup de spécimens humains, nous avons noté beaucoup de variabilité de personne à personne. Il n’y avait aucun moyen de « prédire » à partir desquels nous obtiendrions le BAL avec de bons résultats cellulaires contre de mauvais rendements cellulaires. Contrairement au sang périphérique, qui donne un nombre assez constant de lymphocytes, les nombres de cellules dans le liquide BAL sont très variables. L’injection d’un plus grand volume de solution saline normale dans les poumons (avec l’espoir d’obtenir un plus grand retour du liquide BAL) n’est pas toujours possible car de plus grands volumes de solution saline normale sont souvent associés à plus de toux et à un risque plus élevé de postbronchoscopie de fièvre. Nous avons remarqué que l’utilisation d’un bronchoscope de diamètre plus petit (plutôt que plus grand) a permis au pneumologue d’atteindre plus profondément dans les bronches et d’obtenir du liquide contenant de plus grandes quantités de cellules. Une conclusion cohérente était que les fumeurs de tabac avaient des proportions beaucoup plus grandes d’AMs que les lymphocytes dans leur fluide DEBAL, qui est prévu pendant que les AMs engloutissent des débris et des particules. En outre, nous avons observé que le liquide BAL des fumeurs contenait des débris qui peuvent bloquer l’équipement utilisé, comme les machines PCR et les cytomètres d’écoulement. Des problèmes similaires peuvent être observés dans les zones de forte pollution ou les individus exposés plus fréquemment à une mauvaise qualité de l’air.

En ce qui concerne leur rôle dans l’établissement des réservoirs de VIH et la persistance virale, la pureté des lymphocytes T CD4 et des AM est une considération clé. Pour cette raison, nous avons choisi d’utiliser le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) pour obtenir des populations cellulaires très pures. Il est également possible que le liquide BAL recueilli soit contaminé par du sang, car on s’attend à des saignements mineurs lors d’une bronchoscopie; la présence des cellules Naïves de B indiquerait ceci, et les cellules peuvent être lavées dans un tampon de lyse de globule rouge pour contourner ce problème. Un autre défi avec l’étude du fluide BAL concerne la quantification des marqueurs inflammatoires et des cytokines, qui sont importants pour comprendre la persistance du VIH26. Comme la saline inculquée dilue le fluide BAL, les niveaux de médiateurs inflammatoires et de cytokines peuvent être difficiles à mesurer. Bien qu’un facteur de correction de l’urée ait été proposé pour tenir compte de la dilution, il y a relativement peu de documentation décrivant son utilisation27,28.

Les AM sont très autofluorescents, ce qui pose un problème lors du tri cellulaire et de l’analyse phénométrie cytométrie. En particulier, l’effet est plus prononcé chez les fumeurs dont les AM peuvent être complètement de couleur noire, affectant de manière significative leur autofluorescence. Lorsqu’elle est excitée par un laser bleu standard de 488 nm, l’autofluorescence AM est à son apogée à environ 540 nm, qui chevauche les spectres de fluorescence des conjugués couramment utilisés tels que FITC et PE29,30. Il est à noter que deux lasers distincts peuvent être utilisés pour exciter FITC et PE (par exemple, PE par le jaune / vert et FITC par le laser bleu 488). Pour surmonter l’autofluorescence inhérente à la FITC, nous avons utilisé des AM non tachés pour déterminer le fond d’autofluorescence. En outre, l’utilisation de la fluorescence moins un (FMO) contrôles peuvent être très utiles pour lutter contre ces problèmes techniques. De plus grandes perles (p. ex., 7,5 m) peuvent être utilisées, qui sont plus proches en taille pour compenser les populations de macrophages, comparativement aux perles plus petites (p. ex., 3,0 m), qui peuvent être utilisées pour compenser les populations de lymphocytes. Une approche encore plus appropriée serait d’utiliser une petite fraction de cellules comme les contrôles à seule tache, en utilisant un marqueur connu, très exprimé sur le sous-ensemble, tels que HLA-DR ou CD45, conjugué à chacun des fluorochromes désirés, ce qui permettrait un bien plus une compensation précise que l’on peut obtenir avec des perles. Dans le cas des échantillons de fumeurs, cette tactique est particulièrement utile car les macrophages sont beaucoup plus grands et plus autofluorescents. De plus, à partir de l’étape de préparation, l’ensemble de l’échantillon BAL pourrait être cultivé dans une assiette avant le tri décrit à la section 3 du protocole, afin de permettre une séparation des populations par l’observance. De cette façon, les macrophages adhérents peuvent être isolés d’autres cellules non adhérentes telles que les lymphocytes. L’indemnisation est beaucoup moins difficile si les populations de lymphocytes et de AM sont séparées plutôt que examinées ensemble; cependant, le fait de compter sur l’observance entraînera une perte de macrophages, ce qui est une considération importante lorsque le nombre de cellules est déjà limitatif. En outre, une étape d’adhérence pourrait avoir comme conséquence l’activation non désirée des monocytes adhérents, qui peuvent affecter des résultats en aval produits utilisant ces cellules. La valeur du tri efficace des cellules en populations plus pures doit être évaluée par rapport à la restriction d’avoir moins de ces cellules pour les expériences ultérieures.

D’autres modèles, notamment des modèles murins, ont été utilisés pour étudier les caractéristiques immunologiques et la biologie des macrophages. Bien que ces modèles soient extrêmement utiles et permettent un grand aperçu d’un type de cellule difficile à manipuler, ils ont des limites. Beaucoup de marqueurs de surface cellulaire varient entre les souris et les humains de telle sorte que l’immunophénotype des AM saviennes humaines n’est pas complètement comprise. Cependant, ce système modèle nécessite la mise en commun de plusieurs souris pour les essais en raison du faible nombre de cellules disponibles de chaque animal. En outre, la nécessité de mettre en commun les spécimens empêche les considérations de prédisposition génétique et de sexe. Récemment, il a été démontré que le sexe joue un rôle dans l’infectivité des macrophages par le VIH-1 en raison de l’expression disparate du facteur de restriction SAMHD-131. Les primates non humains (PsN) représentent le modèle le plus proche de l’homme et ont facilité l’étude de l’infection par le virus de l’immunodéficience simienne (IVS) et de son effet sur le système immunitaire, donnant un aperçu du rôle des macrophages tissulaires par rapport aux macrophages dérivés du monocyte. Dans les macaques rhésus, il a également été démontré que les isolats de macrophage pulmonaire de BAL hébergent un virus réplication-compétent ; un analyse virale de excroissance (VOA) a été employé pour analyser le comportement de SIV dans les cellules de tissu-résident32. Une telle constatation est d’une grande valeur de recherche, mais doit encore être validée chez l’homme avant de pouvoir être appliquée, et le coût élevé de l’utilisation des PSN empêche l’utilisation de grandes populations d’échantillons. En outre, les MA humaines seront utiles pour de nombreuses autres applications telles que les essais d’infection virale/microbienne in vitro et dans les études d’autres agents pathogènes tels que la tuberculose/coinfection par le VIH.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs aimeraient remercier leurs bailleurs de fonds : les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (subventions #153082 à CC, MAJ, NC); Le Réseau SIDA et maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) qui a accordé un financement à CC et MAJ et à la Faculté de médecine de l’Université McGill qui ont accordé du financement à CC. Cette étude a également été appuyée en partie par l’équipe de l’entreprise canadienne de soins du VIH (CanCURE) HB2 – 164064 du MAJ, du CC et du NC. Le MAJ est titulaire de la Chaire de recherche du Canada des IRSC de niveau 2 en immunovirologie et CC et NC détiennent respectivement un salaire de recherche FRQ-S Junior 1 et Junior 2. ET détient un prix DEm d’études RI-CUSM.

De plus, les auteurs aimeraient remercier Josée Girouard et tout le personnel clinique impliqué dans la coordination et l’obtention des échantillons, ainsi que les inhalothérapeutes; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette et Marie-Hélène Lacombe à la plateforme d’immunophénotypage RI-CUSM; et le Dr Marianna Orlova pour la fourniture des photos de microscopie. Plus important encore, les auteurs tiennent à remercier les nombreux bénévoles sans qui cette recherche ne serait pas possible.

Materials

70 µm Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22363548 Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting
ACH-2 Cells NIH 349 HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4
BD FACSAria BD Biosciences N/A Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)
BD LSRFortessa X-20 BD Biosciences N/A  Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)
Bronchoscope Olympus BF-1TH190  EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm
Cell Disassociation Solution Sigma C5914  Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.
CD169  BB515 BD Biosciences 565353 Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry
CD14  BV786 BD Biosciences 563698 Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry
CD206  PE BD Biosciences 555954 Mannose receptor antibody used for flow cytometry
CD3  Alexa700 BD Biosciences 557943 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD4  PE-Cy5 BD Biosciences 555348 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD45  PE Cy-7 BD Biosciences 557748 Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry
CD8  BV605 BD Biosciences 564116 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CompBead Plus BD 560497 Anti-mouse  Ig, κ  and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry
DNase I Invitrogen 18068015 Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA
dNTP Set 100 mM Invitrogen  10297-018 Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418  Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells
EDTA Invitrogen AM9912 Used to stop Dnase I enzyme activity
FBS Wisent Bioproducts 080-150 Premium fetal bovine serum to supplement media
FcR Blocking Reagent, Human Miltenyi 130-059-901 Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies
FlowJo v10 FlowJo LLC N/A Flow cytometry analysis software used for all analyses
HLA-DR  BV650 BD Biosciences 564231 MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry
HyClone HEPES solution Fisher Scientific SH3023701 Buffer providing maintenance of physiological pH 
Live/Dead  APC-H7 Invitrogen L34975 Viability marker used for flow cytometry
Lymphocyte Separation Medium (LSM) Wisent Bioproducts 350-000-CL Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher 5100-0001 Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1°C/minute, the optimal rate for cell preservation
OneComp eBeads Invitrogen 01-1111-41 Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples
PBS 1X Wisent Bioproducts 311-010-CL Phosphate buffered saline for cell washing and staining
PCR Tubes Corbett Rotor-Gene Axygen PCR-0104-C 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene
PerfeCTa qPCR ToughMix Quantabio 95112 2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates 
QiaAmp DNA Mini Kit Qiagen 51304 Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers
Rotor-Gene Q Qiagen 9001550 Real-time PCR cycler
RPMI 1640 1X Wisent Bioproducts 350-000-CL Cell culture media
Sterile Water Wisent Bioproducts 809-115-CL DNase, RNase & protease free
Superscript™ III One-Step RT-PCR System  Invitrogen 12574018 RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate
Taq DNA Polymerase  Invitrogen 18038-042 Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride
Transcription Factor Buffer Set BD Biosciences 562725 Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer
Trypan Blue Sigma T8154 Viability dye to count cells using haemacytometer 
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Salahuddin, S., Thomson, E., Méziane, O., Farnos, O., Pagliuzza, A., Chomont, N., Olivenstein, R., Costiniuk, C., Jenabian, M. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. J. Vis. Exp. (148), e59427, doi:10.3791/59427 (2019).
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