שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים

השימוש בדגימות ניתוח מתיחת בטן ובניתוח שטרם אושרה על-ידי לוח הסקירה המוסדי (IRB) של אוניברסיטת רטגרס-קמפוס ניוארק. 1. הכנת מדיה לתרבות רקמות Sterilely להכין 500 mL של מדיה תרבות רקמות לפני בידוד ASCs. כדי להכין את התקשורת התרבותית, להוסיף 10% סרום עגל העוברי (FCS) ו-פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/100 mL) למדיה חיוניים מינימלית של Dulbecco (DMEM) עם גלוקוז גבוה 2 מ”מ L-גלוטמין. התקשורת יכולה להיות מאוחסנת ב-4 ° צ’ עד 3 שבועות, ויש להשתמש בה תמיד חם (בין טמפרטורת החדר עד 37 ° c). אם מדיה אחרת מועדפת לתרבות של תאי הגזע, הכינו במקום זאת את המדיה. 2. בידוד של הפקולטה לרקמה מאדיפוז השג ליפופה או דגימת מתיחת בטן. לאחר אישור IRB, לקבל דגימות כאלה כמו למחוק רקמות בעקבות הליכים כירורגיים שונים. העברת הליחות למעבדה בכלי הניתוח שהמנתח הסיר את הרקמה; מתיחת בטן בחדר ניתוח או במיכל. אחסן את המדגם (ים) בטמפרטורת החדר עבור עד 6 מעלות צלזיוס או ב-4 ° צ’ עד 24 שעות אם לא מעבדים באופן מיידי. דגימות רקמות מעובדות מעבר למועדים הנ ל צפוי להיות התשואה התאים פחתה. שמרו דגימות מתיחת בטן לחות על-ידי תוספת תמיסת מלח באגירה סטרילית מבית 1x. מנקודה זו ואילך, המשך את כל הצעדים בתוך כיסוי הזרימה המבינארי בתנאים אספטי. לבש כפפות להגנה אישית. לשמור על 10% אקונומיקה, 70% אתנול, ומגבות נייר סמוך כדי לנקות במהירות כל דליפת ביולוגי. נפטר מרקמה עודפת. כפסולת ביו-רפואית האוהב את הדגימות לתוך < חתיכות 1 מ"מ. אם בלוק ניתוח הבטן גדול מכדי לעבוד עם, לחתוך גודל של רקמות להיות מחוץ לבלוק לפני המינסינג. העבר את רקמת מתיחת הבטן למכסה של צלחת 100 מ"מ סטרילית. השתמש מחט סטרילית להחזיק פיסת הרקמה במקום ולהשתמש אזמל סטרילי כדי לחזק את החלקים על ידי חיתוך או בעדינות גריסה של רקמות בצובר. שלב זה אינו נדרש בדרך כלל עבור ליפופי. עם זאת, אם נתחי רקמות גדולים הם נצפו בתוך ליפוף, להסיר חתיכות כאלה עם מלקחיים סטרילי תהליך כמו לעיל. להעביר את הרקמה לצינור טרי להפוך או לנער את המדגם 5 – 6 פעמים כדי להבטיח ערבוב של כל השכבות. אופציונלי: אם ליפוף התיישבו במלואו, להסיר ולמחוק את שכבת הנפט לפני ערבוב. העברה 2.5 – 5 מ ל של רקמות לצלחת העיבוד פלזמה של 100 mm גז ואקום (טבלת חומרים). למדוד את נפח המדגם על ידי לשפוך לתוך צינור צנטריפוגה טרי. אם יש צורך, השתמשו במרית סטרילית כדי לסייע בהעברת הרקמה. הוסף נפח שווה ערך של מדיית תרבות הרקמה לצלחת. מערבולת בעדינות את הצלחת לערבב את התוכן. מודקת את פאטה ב 37 ° צ’ ב 5% CO2 עד מספר מספיק של תאים נראים על בסיס הצלחת. עם הזמן, התאים יועברו מתוך הרקמה על פני השטח צלחת, ובנקודה זו הם לדבוק פלסטיק. כאשר הם יוצאים הרקמה, התאים יופיעו כאשכולות קטנים סביב חתיכות הרקמה. כל 24 שעות, להסיר כמה שיותר נוזלי ולהחליף עם כמות דומה של מדיה. השאירו את פיסות הרקמה במקום, אם אפשר. לאחר מספר מספיק של תאים מצוין על הצלחת (> 10 אשכולות של > 15 – 25 תאים על הצלחת) או לאחר 7 ימים, לפי מוקדם יותר, להסיר את כל החלקים הנותרים של רקמות. התרבות ASCs במדיה התרבות רקמות עד שהם מגיעים 70% השטף או עד האשכולות להיות צפוף (> 5 אשכולות צפופים של תאים על הלוח, כל אחד עם קוטר של כ > 500 μm), ובשלב זה התאים הם להיות החוצה. 3 התרבות של ASCs העבר את ה-ASCs כאשר לוחית ההורה מגיע כ 70% שליטה. שמור על עצמך להימנע משטף של התרבויות עולה. שטפו בעדינות את הצלחת עם מלוחים באגירה של 1 x פוספט וטריזיציזציה לתאים החסיד. לטריזיסיזציה של התאים, מוחלק את תמיסת המלח באגירה ומוסיפה 1 מ ל טריפסין עם 0.25% EDTA לכל צלחת ו מודרת ב 37 ° c עבור 5 דקות. לאחר 5 דקות, אשרו הדבקות במיקרוסקופיה. אם התאים עדיין מחסיד, להחזיר את התאים לחממה עבור 5 דקות נוספות. הוסיפו כמות קטנה של מדיה (כ -25% מכמות הטריפסין הכוללת) לצלחת לבטל את הטריפסין, ולשטוף בעדינות את בסיס הצלחת באמצעות המדיה/טריפסין. כדי לשטוף את הצלחת, החזיקו את הצלחת בזווית קלה ומצנקת בעדינות את המדיה/טריפסין מראש הלוחית כלפי מטה, ומתרופפות כל תא שבועי מהצלחת. התאים יכולים להיות מצופה מחדש ביחס 1:3 או הנזרע בצפיפות של 120000 – 500000 תאים לכל צלחת. אם זריעה מבוסס על ספירת תאים, להעביר את טריפסין/מדיה מן הצלחת לתוך צינור צנטריפוגה חרוט, ואת הגלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 7 דקות. להשעות את התאים במדיה של תרבות רקמות (כ 1 מ”ל לכל לוחית הראשונית) ולספור את התאים לפני זריעה. כדי לספור את התאים, להעביר 10 μL של ההשעיה התא לתוך ה, ולספור את התאים הנמצאים 4 x 4 הרביע בכל פינה של הרשת. ממוצע ערכים אלה יחד והכפל את הערך ב-104 כדי לחשב את מספר התא. הוסף מדיה ללוח לפני זריעת התאים. להוסיף את התאים באופן dropwise ולאחר מכן מערבולת את הצלחת כדי להבטיח הפצה אפילו על פני הצלחת.הערה: לאחר 3 מעברים, התאים החסיד אמורים להופיע א-סימטרי וצורת ציר. פנוטיפ עולה והתנהגות ניתן לאשר באמצעות הזרמת cy, לנסות בידול. אישור של פנוטיפ והתנהגות באמצעות הזרמת cy, ובידול מוסר ציטומטלי זרימה איסוף והגלולה התאים כמתואר לעיל. לשטוף את הפלטד עם מלוחים 1x פוספט באגירה ולתייג את התאים עם מומלץ ליצרן כרכים של נוגדן. פרוטוקול מפורט להזרמת cy, הליך מעבדה נפוץ, ניתן למצוא כאן12,14,15. בחר לוחות סמן משטח מתוך הפעולות הבאות כדי לאשר את הפנוטיפ עולה: שלילי עבור CD14, CD31, CD34, CD45 וCD106; וחיובי לCD29, CD36, CD44, CD73, CD90 ו-CD10516,17,18,19. הנוכחות של CD36 והיעדרות של CD106 להבחין ASCs מ מח עצם-נגזר MSCs20. בידול אספאומר: לאשר בידול רב שושלת באמצעות ערכת בידול MSC. ערכות זמינים מיצרנים מרובים כדי לאשר אדיפוגניים, אוסטגניים, כונדרוגניים קיבולת הבידול. לשנות את ערכת המדיה סיפק כל 3 – 4 ימים לפי הפרוטוקולים של היצרן עבור 3 שבועות או עד מורפולוגית הבידול הוא נצפתה. מתרבות תאים למעברים מרובים; מספר המעברים הדרושים יהיה תלוי ביישום (ים). בכל מעבר, לאשר את מורפולוגיה התא MSC ופנוטיפ באמצעות סמני פני השטח התא הנ ל, ולהבטיח קיבולת בידול רב השושלת לא אבדו. בעוד הפוטנציאל ההתרחבות שונה בין תורמים, רוב הדגימות ניתן להרחיב עד 6-9 מעברים. קריופלקס התאים ולאחסן בחנקן נוזלי לשימוש עתידי. 4 הקריוגנית של ASCs הכינו 10 מ ל של פתרונות הקפאה A ו-B. עבור פתרון הקפאה A, להוסיף 20% FCS כדי DMEM זיכרון עם גלוקוז גבוה. עבור פתרון הקפאה B, להוסיף 20% FCS ו 20% diמתיל גופרתי (DMSO) ל-DMEM זיכרון עם גלוקוז גבוה. גלולה התאים על ידי תפרידו ב 300 x g עבור 5 דקות. השהה מחדש את התאים בנפח קטן של פתרון הקפאה a ולספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר כמו בשלב 3.3.1. חשב את אמצעי האחסון הסופי שבהם התאים יהיו מושעים מחדש כדי להגיע לריכוז התא הסופי של 500000 – 1000000 תאים/mL. השתמש בפתרון הקפאה A כדי להשעות מחדש את הגלולה ב 50% של הכרך הסופי. הוסיפו באיטיות את הנפח השווה של פתרון ההקפאה B בזמן שהוא מתחשל בצינור כדי להגיע לריכוז התא הסופי. הקפא מיד את התאים ב-1-2 מ ל קריובקבוקונים. הקפא את הקריובקבוקונים במקפיא בקצב מבוקר או במיכל קפוא הממוקם ב-80 ° c, המקטין את הטמפרטורה ב-1 ° c/min. בעקבות ההקפאה מבוקרת (לילה עבור מכולה קופא), להעביר את התאים חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.