单分子荧光原位杂交 (SM-FISH) 在小鼠卵母细胞中 Mrna 的定量和定位

逆转录酶聚合酶链反应 (PCR) 已成为 mRNA 定量的黄金标准。目前使用的是数字 PCR (dPCR)¹和定量实时 Pcr⁽ qpcr) 2 两种检测方法。在两种 PCR 技术中, dPCR 的灵敏度高于 qPCR, 表明它可用于测量单个细胞中的 mRNA 丰度。然而, 在我们手中, dPCR 分析低丰度 Mrna 池5至10个卵母细胞每个实验样本产生的数据具有低重现性和高变异³。这可能是由于与 RNA 提取和逆转录酶效率相关的实验错误。Rna 测序也使用单个小鼠和人类卵母细胞^4,5进行。这种技术需要图书馆生成所需的 cDNA 扩增步骤, 这可能会增加实验组内的可变性。此外, 低丰度成绩单可能无法检测到。虽然测序价格在过去几年有所下降, 但由于生物信息学分析的成本很高, 测序价格仍然可能高得令人望而却步。最后, mRNA 定位是一个动态过程, 空间变化对蛋白质功能^有影响。因此, 我们开始采用一种技术, 将产生准确和可重复的定量措施和定位单个卵母细胞中的单个 Mrna。

分支 dna 与荧光原位杂交结合, 可放大荧光信号, 而不是放大 nnacdna, 从而能够检测单个细胞^7,8,9中的单个 mrna。该检测是通过一系列的杂交, 扩增 (使用分支 DNA), 和荧光标记步骤, 以放大荧光信号⁷。该技术从结合 18———————————————————————————————为每个转录记录设计了15到20对探针对, 以确保目标转录的特殊性。Mrna 特异性杂交之后是前放大器和放大器探头, 形成分支配置。大约400个标签荧光与每个放大器结合在一起, 从而使荧光增加 8000倍, 从而可以检测到单个 Mrna (图 1)¹¹。

图 1: sm-fish 协议的原理图.结果显示了转录特异性探针、分支 DNA 放大器和荧光体与靶向 mRNA 的顺序杂交。请点击这里查看此图的较大版本.

以往的研究使用单分子荧光原位杂交 ( SM – FISH ) 局部β – 肌动蛋白 Mrna 在单个神经元 12 和人状瘤病毒 dna 在宫颈癌细胞^{系 7}。计算机软件 “现场查找和跟踪程序” 可识别单个点点荧光信号, 并已成功地用于量化每个单元^{3、13 中}的 mrna 数量。

根据神经元¹²中 mrna 检测的结果, 我们假设 sm-fish 将被证明是一个有用的工具, 用于定量小鼠卵母细胞和胚胎的转录水平, 包括低丰度 mrna。然而, 该技术是优化使用与粘附固定细胞和甲醛固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织切片。卵母细胞不能粘附在滑块上, 即使它们被涂上多-l-赖氨酸。此外, 当在市售的试剂盒3中使用一些专有缓冲液时, 它们比体细胞和组织切片更脆弱, 从而导致细胞裂解。为了克服这些挑战, 卵母细胞被固定, 并在缓冲液滴之间手动转移。此外, 还更换了试剂盒中的渗透和洗涤缓冲液, 以减少细胞裂解。预先设计的探头与 FISH 套件一起购买, 或可以要求提供具体的成绩单。每个专有探针集都可以在三个荧光通道 (C1、C2 和 C3) 中的一个中使用, 以允许多路复用。在目前的实验中, 使用 C2 Nanog 探针和 C3 Pou5f1 探针对小鼠卵母细胞进行了双重染色和定量。这些探针是根据报道的纳诺格和Pou5f1在卵母细胞和胚胎中的表达情况选择的。在杂交步骤结束时, 卵母细胞被放置在防褪色安装介质的滴中, 用于组织学幻灯片。共聚焦图像被用来量化表示单个 Mrna 的点点荧光信号的数量。除了对 Mrna 进行量化外, 成像还显示了细胞中特定 mRNA 的空间分布, 而其他 RNA 定量方法是无法实现的。这项技术被证明在实验组中具有较低的变异性, 允许在每个实验组中使用较少数量的卵母细胞来识别实验组³之间的显著差异。