단백질 분리 및 특성에 대 한 다 각 산란 (MALS)를 결합 하는 이온 교환 크로마토그래피 (전류 구동)

1입니다. 시스템의 준비 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템 및 MALS/굴절 인덱스 (RI) 검출기 ( 재료의 표참조) 컨트롤, 데이터 수집, 및 제조 업체는 당 분석에 대 한 그들의 각각 소프트웨어 패키지와 함께 설치 지침입니다. FPLC의 UV와 전도도 검출기의 하류 아니라 MALS 및 RI 검출기를 연결 합니다. UV와 MALS 감지기 사이 interdetector 볼륨을 최소화 하기 위해 pH 기울기에 대 한 절대적으로 필요한 경우가 아니면 전화 탐지기를 우회. 0.25-0.5의 모 세관 튜브를 사용 하 여 m m 내경 (아이디) 열 탐지기와 폐기물 또는 수집기에 RI 검출기의 출력 0.75 m m i.d. 모 세관 배관 사이. 그 FPLC과 감지기 사이 필요한 신호 연결 설립 되었습니다, MALS Aux 입력에 FPLC 검출기에서 UV 아날로그 출력 및에 MALS Autoinject, I/O 상자 통해는 FPLC에서 디지털 출력을 포함 하 여 확인 합니다. 2입니다. 샘플 및 버퍼의 준비 0.1 µ m 필터 세척 및 차입 버퍼를 포함 하 여 모든 시 약을 필터링 합니다. 건조 필터에서 입자를 제거 하기 위해 폐 병으로 버퍼의 첫 번째 50-100 mL를 필터링 하 고 필터링 된 물으로 철저 하 게 세척 되 고 입력에서 먼지를 방지 하기 위해 출장 청소, 살 균 병에 버퍼의 나머지를 유지. PH, 이온 강도에 BSA 샘플 조정 (예를들면, pH = 8, 50 mM NaCl) 희석, 한, 또는 버퍼 교환 절차 동안 전류 구동 열 바인딩 수 있도록.참고: 것이 좋습니다 관심의 자료를 제거 하지 않는 작은 기 공 크기로 단백질 샘플 prefilter (0.02-0.1 µ m). 또는, 큰 입자의 강 수 있도록 10 분 샘플 고속 (13000-16000 x g) centrifuged 될 수 있습니다. 적어도 0.3-0.5 준비 BSA의 mg ( 재료의 표참조) 좋은-품질 MALS 분석을 달성 하기 위한 1 mL 열 (5/50 m m)에 삽입. 참고 주입의 볼륨 제한 되지 않습니다. 3. 선택과 단백질에 대 한 전류 구동 방법의 개발 Protparam 도구 는 ExPASy에 있는 서버에 대 한 웹사이트 사용된15수 기본 시퀀스에 따라 단백질의 전자 점 (pI)을 계산 합니다. 참고 BSA의 pI 5.8입니다. 열 유형 및 버퍼 매개 변수를 선택 합니다. pK는는 버퍼와 버퍼의 이온 특성에 따라 AIEX와 CIEX, 다른 버퍼를 사용 합니다. AIEX 열과 음이온 버퍼 작은 counterions CIEX 열에서 실행할 때 실행할 때 양이온 버퍼를 사용 합니다. 이 예제에서 20 mM Tris HCl 버퍼, pH 8, AIEX 열에 BSA의 분석을 사용 합니다. BSA, 등 7 보다 낮은 pI와 단백질에 대 한 두 개 이상 단위에 의해 파이 보다 더 높은 ph는 AIEX 열 및 버퍼를 사용 합니다. 7 보다 높은 pI와 단백질에 대 한 두 개 이상 단위에 의해 단백질 pI 보다 낮은 ph CIEX 열 및 버퍼를 사용 합니다. 바인딩 단백질 사이의 열 매트릭스의 강도 따라 버퍼 pH 최적화. 단백질 잘 열에 바인딩되지 않습니다, pI에서 pH를 사용 합니다. 단백질 사용된 pH에 안정 되어 있는지 확인 합니다. 낮은 염 농도 사용 하 여 바인딩에 고 단백질 바인딩 로드 샘플의 이온 강도에 따라 달라 집니다 이후 행렬에 단백질의 바인딩을 허용 하는 버퍼를 씻어. 단백질의 안정성에 대 한 몇 가지 소금 필요 따라서, 단백질 로드 및 열 세척 단계 동안 50 m m NaCl (또는 대체 소금)을 사용 합니다. 차입 버퍼에 대 한 최대 0.5 M NaCl 사용 하 여 열에서 단백질을 분리.참고: 높은 소금 농도 표준 모델 RI 굴절 계 악기의 범위 제한 때문에 작업할 때 권장 하지 않습니다. 그러나, 고 농도 모델 사용 될 수 있다 그리고 2 M NaCl을 수용할 것입니다. 초기 메서드를 다음과 같이 수행 합니다. BSA의 1 mg 로드 (6 mg/mL의 170 µ L) 20 mM Tris HCl 버퍼, pH 8의 로딩 버퍼의 ~0.5 mL에서 50 mM NaCl을 포함 하. 빛 산란 (LS), UV 때까지 바인딩되지 않은 분자 및 입자 시스템에서의 완전 한 차입을 허용 하는 10-15 열 (CV) 볼륨에 대 한 동일한 버퍼 열 세척 하 고 RI 신호는 완전히 안정. 20-30 이력서, 20 mM Tris HCl, pH 8의 차입 버퍼를 사용 하 여, 포함 하는 열에서 단백질을 분리 하 0.5 M NaCl의 짧은, 선형 솔트 그라디언트를 수행 합니다. 차입 버퍼의 0%-100% (또는 대체 광범위 한 그라데이션)의 그라디언트를 수행 하거나 두 그라디언트를 분할: 차입 버퍼의 0%-50%는 추가 그라데이션 차입 버퍼, 10-20 이력서에 대 한 각 그라디언트의 50%-100%의 뒤에. BSA, 30에 대 한 광범위 한 그라데이션 15%-70%의 사용 초기 방법에 대 한 이력서.참고: 어떤 경우에, 초기 방법을 제공할 수 있습니다 신뢰할 수 있는 MALS 분석에 대 한 분리 그리고 추가 실행이 필요 하지 않습니다. 대부분의 경우, 초기 메서드 추가 방법 최적화에 대 한 지침을 제공합니다. 해상도 증가 하 고 다른 매개 변수를 변경 하 여 피크 분리를 개선 하는 전류 구동 메서드를 최적화 합니다. 그라데이션 경사와 길이 변경 합니다. 높은 슬로프와 짧은 그라디언트 가벼운 슬로프와 긴 그라디언트 제공 더 나은 분리 낮은 봉우리 적은 분리와 함께 강렬한 봉우리를 제공 합니다. 최적의 MALS 분석에 대 한 최대 해상도 및 신호 강도 사이의 균형을 찾아.참고: LS, UV, 증가할 수 있다 단백질의 높은 수량을 로드 하 고 RI 신호 하지만 해상도 비용 않습니다. 차입에 대 한 단계적 소금 농도 프로 파일을 사용 합니다. 단계 및 선형 그라데이션의 조합 일반적으로 사용 되는 기억 하십시오. 피크 분리 개선 흐름 속도 감소.참고: 아주 작은 입자와 함께 행렬에 대 한 이건 매우 중요 한입니다. 샘플에서 단백질 인구 사이 충전 편차를 증가 하 고 그 변종 사이의 분리를 향상을 버퍼 pH를 변경 합니다. 참고 한 pH에서 제대로 분리 되지 단백질 다른 pH에서 분리 될 수 있다. 그라데이션, 선형 또는 stepwise, pH를 사용 하 여 전류 구동 열 로부터 단백질을 분리. PH 및 소금 농도 변화가 필요한 경우 결합 하는 차입 그라디언트를 사용 합니다. 강한 염, MgCl2또는 약한 소금 나트륨 아세테이트, 등 등을 사용 하 여 감도 및 해상도16증가. 분리 능력을 향상 시키는 작은 입자와 더 이상 전류 구동 열 또는 다른 열 매트릭스를 사용 합니다. 열 (AIEX/CIEX) 분리의 다른 패턴을 제공 하기의 형식을 변경 합니다. 참고는 강한, 약한, 또는 결합 된 (혼합 모드) ligands와 행렬도 사용할 수 있으며 일부 샘플의 해상도 향상 시킬 수 있습니다. 다른 매트릭스 수 지에 연결 된 동일한 ligand와 다른 공급 업체에서 열을 사용 합니다. Ligand, 별도로 수 지 자체, 단백질와 다르게 상호 작용 하 고 분리 프로필에 영향을 미칠 수 있습니다. 단백질 안정성 향상 및 전류 구동 실험을 개선 하기 위해 단백질 집계를 피하기 위해 버퍼에 첨가제 (안정화 솔루션에서 단백질 분자)를 포함 합니다.참고: 이러한 첨가제는 설탕, 알콜, 우 레 아, 비 또는 zwitterionic 세제, 그리고 chaotropic 및 kosmotropic 소금17,18. 4. 전류 구동 MALS 실험 New\Experiment 메서드에서 MALS 소프트웨어에서 열고 빛 산란 시스템 방법 폴더에서 온라인 메서드를 선택 합니다. DLS 모듈 사용할 수 있는 DL 데이터 취득 하는 경우에, 빛 Scattering\With QELS 하위 폴더에서 온라인 메서드를 선택 합니다. 구성 섹션에서 실행의 매개 변수를 설정 합니다. FPLC (1.5 mL/min)에서 사용 하는 유량에 일반적인 펌프 섹션에서 실행의 흐름 속도 설정 하 고 입력 하거나 용 매 섹션에서 버퍼 매개 변수를 확인 합니다. 단백질 이름 (BSA), 굴절률 증가 입력 (dn/dc; 표준 단백질에 대 한 값은 0.185 mL/g), 280의 파장에 UV 소멸 계수 (0.66 g/L-1·cm-1), 및에서 단백질 견본 (6 mg/mL)의 농도 인젝터 섹션 아래 샘플 탭. 같은 섹션에서 또한 주입 (170 µ L)에 대 한 샘플 볼륨을 삽입 합니다. 프로시저 섹션에서 기본 컬렉션 탭에서 Autoinject에 트리거 확인란을 선택 하 고 그라디언트에 도달 하면 적어도 5 분 동안 데이터 수집을 계속 것 이다 있도록는 실행 기간을 설정의 최종 값입니다. FPLC 소프트웨어에서 실험 매개 변수를 설정 합니다. 메서드 편집기 탭에서 새 실험을 만듭니다. 초기 실험 소금 또는 산도의 선형 그라데이션 됩니다 (단계 3.3 참조). 최적화 방법에 대 한 좀 더 구체적인 그라데이션 또는 차입 결과 단계적 프로그램 동안 만드는 초기 메서드 (3.4 단계 및 그림 1참조). MALS 소프트웨어에서 데이터 수집을 트리거하는 방법에는 펄스 신호를 포함 합니다. 열과 관련 된 버퍼와 밸브 세척: 세척 버퍼 (밸브)와 500 m m NaCl 차입 버퍼 (B 밸브)에 대 한 동일한 버퍼에 대 한 50 m m NaCl 20 mM Tris HCl, pH 8. 마지막 열 세척이 낮은 소금 농도 포함 하는 바인딩 버퍼를 사용 하 여 열 매트릭스에 단백질의 바인딩을 활성화는 다는 것을 확인 하십시오. 강력 하 게 바인딩된 불순물의 대규모 세척, 중화 버퍼 세척 뒤 관련 버퍼와 세척 하기 전에 0.5 M NaOH를 사용 합니다. 주사기를 사용 하 여 루프에서 단백질 견본을 놓습니다. 샘플의 10 mL 이상의 로드 하는 경우 필터 펌프와 믹서는 FPLC의 무시 하면서는 superloop 또는 FPLC 악기의 펌프 밸브를 사용 합니다. 실험 처음 시작 MALS 소프트웨어에서 그리고 FPLC 소프트웨어에서 실행 버튼을 클릭 하 여. MALS 검출기를 통해 FPLC 악기에서 펄스 신호를 받은 후 데이터를 수집 합니다. 실행 및 독립 실행형 메서드 대신 연속 흐름 모드 전류 구동 MALS 수동으로 수행 하는 경우 단계 4.1-4.4에서에서 설명 하는 지침의 동일한 매개 변수를 적용 합니다. 마지막 방법은 확인 되 고 실행 후 빈 주입 (샘플 대신 로딩 버퍼)를 사용 하 여 정확 하 게 같은 방법을 수행 합니다. Autoinject 펄스 사이의 빈 실행의 그라데이션 타이밍 실행 하는 샘플의 동일은 중요 하다. 5. 전류 구동 MALS 실험 데이터의 분석 MALS 소프트웨어에서 분석 절차 섹션 아래 단계를 수행 합니다. 기본 컬렉션 뷰 실험의 원시 데이터 컬렉션을 표시합니다. Despiking 탭을 사용 하 여 그들은 소음을 많이 전시 하는 경우는 chromatograms를 부드럽게. 일반적으로, 정상적인 수준을 사용 합니다. 모든 신호를 위한 기준 정의 (모든 LS, UV, 그리고 RI 검출기) 기본 보기에서. 분석에 대 한 봉우리 봉우리 보기 정의 합니다. 각 피크에서 단백질을 위한 UV 소멸 계수 및 dn/dc의 올바른 값을 확인 합니다.참고: 단백질, 그것은 0.185 mL/g 표준 RI 증분 값을 사용 하 여 일반적인 하지만 다른 고분자에 대 한 다른 dn/dc 값 사용 해야, 분자의 특성에 따라. Polynucleotides (DNA/RNA)의 평균 dn/dc는 0.17 mL/g19, saccharides, 자당, 같은 0.145 mL/g20 의 평균 dn/dc 값 있고 지질과 세제 범위 0.1-0.16의 dn/dc 값 mL/g21. 어 금 니 질량 및 반지름 피팅 매개 변수 그리고 분자량 및 LS에서 반경 및 QELS에서 Rh 보기 아래에서 상관 함수를 사용 하 여 분석 합니다. 전류 구동 MALS 동안 크게 RI 신호 변경 소금 농도 증가로 인해 실행합니다. 따라서 RI 데이터를 필요로 하는 대량 계산에 대 한 빈 주입에서 기준 신호를 뺍니다. 단백질 및 빈 전류 구동 MALS 실험을 엽니다. 단백질 실험 이름을 마우스 오른쪽 단추로 누릅니다, 그리고 적용 방법, 고 기준 빼기 폴더 파일 대화 상자에서 선택 하십시오. 표준 어 금 니 질량 분석에 대 한 메서드 (예: 온라인)의 올바른 유형을 선택 합니다. 참고 매개 변수 및 설정 단백질 실험에 대해 정의 된 새 열된 방법에 저장 됩니다. 초기 빼기 보기 가져오기 빈 빈 실행의 신호를 가져오려면 클릭 합니다. 악기 (옆 빈 가져오기 버튼)에서 모두 뺄 검출기의 선택 합니다. 솔루션의 RI12실행된 동안 변경 이후 봉우리 보기에서 단백질 피크 지역에 해결책의 전도도 때문 dn/dc 값 (필요한 경우)를 조정 합니다. BSA 단위체와 전류 구동 MALS 시스템 보정.참고: 일반적으로, 전류 구동 MALS 시스템은 주기적으로 보정 피크 정렬, 밴드 확대, 및의 선회 (Rg)의 반경 가진 단 분산 단백질을 사용 하 여 90 °의 검출기 각도 검출기의 < 10 nm, BSA 단위체 등. 이 예제에서는 BSA 모두 교정 분자 하며 자체 어 금 니 질량 분석의 주제 이다. 절차 에 따라 봉우리 정렬 > 구성 보기. 3.0 입력 정규화 보기 아래 정규화 수행 Rg 값으로 nm. 동일한 구성 탭에서 밴드 확대 를에서 피크를 선택 하 고 맞는 수행 버튼을 사용 하 여 RI 신호에는 UV 및 LS 신호를 일치 합니다. 결과의 그래프 결과 피팅 보기에 표시 됩니다. 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 편집을 선택한 다음 고급 버튼을 클릭 하 여 축 비늘과 다른 그래프 매개 변수를 변경 합니다. 더 많은 디스플레이 옵션 그래프 그림은 또한 EASI 그래프 탭에서 사용할 수: 윈도우의 상단에 표시 하는 드롭 다운 메뉴에서 선택 하는 어 금 니 질량 . 참고 어 금 니 질량, 반지름, 순도의 수준 및 다른 사람를 포함 하 여 모든 결과 결과 섹션에서 보고서 보기 요약 (세부)에서 사용할 수 있습니다. 보고서 디자이너 단추를 사용 하 여 보고서에 더 많은 결과 또는 매개 변수를 뿐만 아니라 숫자, 추가.