Høy-resolution 3D tenkelig av rabiat virus infeksjon inne løsemiddel-klarnet hjerne tissue

Konvensjonelle histologi teknikker meste stole på tynne deler av orgel vev, som kan iboende gir bare 2D innsikt i en kompleks 3D-miljø. Selv gjennomførbart i prinsippet, 3D rekonstruksjon fra serielle tynne seksjoner krever krevende tekniske rørledninger for både kutting og påfølgende i silisiummangan justering av ervervet bilder¹. Videre er sømløs rekonstruksjon av z-volumer etter mikrotomen kutting kritisk, da både mekaniske og beregnings gjenstander kan forbli på grunn av suboptimal bilde registrering forårsaket av nonoverlapping bilde plan, fargevariasjoner og fysiske ødeleggelse av vev av for eksempel mikrotomen bladet. I kontrast, ren optisk kutting av intakt tykke vevsprøver gjør at oppkjøpet av overlappende bilde plan (oversampling) og dermed Letter 3D rekonstruksjon. Dette i sin tur er svært gunstig for analyse av smitte prosesser i komplekse celle populasjoner (f. eks neuronal nettverk i sammenheng med de omkringliggende gliacellene og immunceller). Men iboende hindringer av tykt vev seksjoner inkluderer lysspredning og begrenset antistoff penetrasjon inn i vevet. I de senere årene har en rekke teknikker er utviklet og optimalisert for å overvinne disse problemene^{2,3,4,5,6,7,8 , 9} andre priser ^{, 10} andre ^{, 11} flere ^{, 12} flere ^{, 13}. i hovedsak er målet vev slått optisk transparent ved behandling med enten vandig²,^{3,4,5,6,7 ,8,9} eller organiske løsningsmiddel BAS^{ert 10,11,12,13} løsninger. Innføringen av 3DISCO (3D Imaging av løsemiddel-ryddet organer)^11,12 og dens etterfølger uDISCO (ultimate 3D Imaging av løsemiddel-ryddet organer)¹³ ga en relativt rask, enkel og rimelig verktøy med utmerket clearing evner. De viktigste bestanddelene av clearing-protokollen er organiske løsemidler tert-BUTANOL (TBA), benzylalkohol alkohol (ba), benzylalkohol BENZOATE (bb), og difenyleter ETER (DPE). Utviklingen og tillegg av iDISCO (immunolabeling 3D-avbildning av løsningsmiddel klarerte organer)¹⁴, en kompatibel immunostaining-protokoll, utgjorde en annen fordel i forhold til eksisterende metoder og aktiverte den dype vevs merkingen av antigener av interesse, samt langtidslagring av immunostained prøver. Kombinasjonen av iDISCO¹⁴ og uDISCO¹³ gir således Høyoppløselig bilde av antistoff-merket proteiner i store vevs seksjoner (opptil 1 mm) ved bruk av konvensjonelle CLSM.

Bevaring av et organ er kompleks struktur i alle tre dimensjoner er spesielt viktig for hjernevevet. Neurons utgjør en svært heterogen mobilnettet pasientpopulasjonen med svært varierte 3D-morfologier basert på deres neurite anslag (gjennomgått av Masland¹⁵). Videre består hjernen av en rekke avdelinger og subcompartments, hver bestående av forskjellige cellulære subpopulasjoner og forhold derav, inkludert gliacellene celler og neurons (gjennomgått av von Bartheld et al.¹⁶). Som neurotropisk virus, den rabies virus (RABV, gjennomgått av Fooks et al.¹⁷) infiserer hovedsakelig neurons, bruker deres transport maskiner til å reise i retrograd retning langs axons fra den primære stedet for smitte til sentralnervesystemet (CNS). Protokollen som beskrives her (figur 1A) tillater immunostaining-assistert deteksjon og VISUALISERING av RABV og RABV-infiserte celler i store, sammenhengende bilde stabler Hentet fra infiserte hjernevev. Dette muliggjør en objektiv, 3D høyoppløselig vurdering av infeksjons miljøet. Det er aktuelt å hjernevev fra en rekke arter, kan utføres umiddelbart etter fiksering eller etter langtidslagring av prøver i paraformaldehyde (PFA), og tillater lagring og reimaging av farget og ryddet prøver i månedsvis.