自己免疫の混合キメラ モデルの光活性化によって個々 の自己反応性濾胞を尋問

すべての動物の使用は、欧州共同体ガイドラインに適合し、デンマークの動物研究官 (2017-15-0201-01348) によって承認されました。 1. 一般的なマウス飼育およびバッファーおよびツールの準備 家マウスの標準的なガイドラインによると健康状態の定期的なモニタリングと特定病原体無料 (SPF) の条件下での行。 (省略可能) 非監視不定感染症による素朴なマウスの自発の胚中心の不在を確認してください。これは蛍光顕微鏡 (胚中心構造の存在) で行うことができます。 またはフローサイトメトリー (胚中心 B 細胞の頻度) 前述12として。注: いずれかの女性または男性を使用することができます。一般的に、男性 Y 抗原に向かって alloreactivity する女性受信者/ドナー15セックスの不一致に理論的になるためのセックス一致ドナーと受信者、理想的です。 使用 CD45.1 受信者 (B6。SJL -Ptprc Pepcbの/BoyJ) 時代の 6-10 週頃。564Igi を使用 (B6。Cg-Ightm1 (Igh564) TikIgktm1 (Igk564) Tik/J) と PA GFP (6-12 週齢で B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) ドナー。 オートクレーブ滅菌手術器具 (微細直線はさみ・ デュモン鉗子 #5 と #7) 日常的滅菌ガイドラインに従ってそれら。 500 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、2% 胎仔ウシ血清 (FBS)、pH 7.4 で 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む骨髄 (BM) バッファーを準備します。BM のバッファーを準備するには、追加の熱不活化 (1 時間、補体を不活化する 56 ° C の水浴中) 10 mL FBS と 1.25 mL をよく混ぜる、pH 7.4 では、PBS の 500 mL 400 mM EDTA の溶液 (pH 7.4 に調整)。0.2 μ m フィルター フラスコを使用してバッファーをフィルター処理します。 試薬グレードの水総量の 10 mL に 10 x の在庫の 1 mL を希釈して 10 mL の赤血球 (RBC) 換散バッファー (155 mM NH4Cl、12 mM NaHCO3、0.1 ミリメートルの EDTA) を準備します。5 ミリメートルの EDTA、pH 7.4 と PBS の 50 mL を準備します。 2. 混合骨髄キメラの確立 受信者 (0 日目) の照射 適切な照射容器内 CD45.1 骨髄の受信者を置き、1,100 と照射ガンマ照射で Rad。注: 代替の照射源が使用できます。ソースにかかわらず用量/タイミングは動物に最小限の巻き添え組織の損傷と最大破壊的効果をもたらす最適化するようにしました。 抗生物質の場所水奏 (sulfadiazin とトリメトプリム/mL の飲料水の 0.2 mg 1 mg となる)。 骨 (1 日) の抽出 564Igi 骨髄ドナーを空気中で 4% イソフルランの連続的な流れによって麻酔し、頚部転位によって安楽死させます。エタノールとドナーをスプレーし、流フードで滅菌手術用パッドの上に置きます。滅菌バッファーおよび機器を使用、無菌状態を維持する作業に進みます。 大腿骨と脛骨を抽出するには、まず足首の周り切開し、微細直線はさみを使って腰に上向きに拡張します。頑丈な鉗子または親指と人差し指を使用して、引き上げて皮膚、体に向かって足を。足と同様に皮膚を引っ張ってください。 ヒップで脚をつかんで足を強制的に引っ張ってくる膝と足首の関節をポップします。足首の関節を破るし、脛骨、それにより腱と脛骨を筋肉を除去、体に向かって足を引っ張るに進みます。 膝の脛骨を解放する共同を破るし、同様にそれにより腱と大腿骨を筋肉を除去、大腿骨を保持しながらこの体の方へ引っ張る。股関節に切開を作るし、腱を切って、大腿骨の股関節ソケットから引き出します。2.2.2-側の 2.2.4 の手順を繰り返します。 すべての残りの筋肉や結合組織を除去するために粗いペーパー タオルで擦ることで骨を慎重にきれい。最後にデュモン #7 ピンセットのペアを使用して氷の上で新鮮な冷たい BM バッファーへ転送する前に、冷たい BM バッファーでリンスします。ステップ 2.2 PA GFP ドナーに対して繰り返します。メモ: 単一のドナーから骨髄細胞数は、性別と年齢によって異なります。目的の入力骨髄比と数字によるとドナーの数と必要な受信者数をスケールします。ドナーが不足している、フロント手足が骨髄抽出に含まれてすることができます。これは通常、後肢から得られる細胞の 1/2 に追加 1/3 を生成します。通常、どこでも 5000 万の細胞からリカバリ可能なドナーは、年齢、性別、背景、唯一後肢両方ハインドやフロント手足が含まれているかどうかに応じてあたり。 骨髄細胞抽出 冷たい BM バッファーで洗浄して、モルタルを準備します。洗浄バッファーをドレインし、10 mL の血清ピペットで 10 mL の新鮮な冷たい BM バッファーを追加する電動ピペット コント ローラーを使用します。 デュモン #7 ピンセットのペアを使用してモルタルを 564Igi ドナーから骨を転送し、粉砕し、骨髄を解放する骨を挽く杵を使用します。10 mL の血清ピペット骨髄エキスを吸引し、氷の上 50 mL のチューブに 70 μ m セル ストレーナー渡します。 モルタルに新鮮な冷たい BM バッファーの追加の 10 mL を追加し、細胞の完全な回復を確実に繰り返します。ペーパー タオルでモルタルから骨素材を削除、適切に破棄し、BM バッファーに続いて、70% エタノールで慎重にモルタルをすすいでください。PA GFP 骨髄ドナー グループの 2.3 の手順を繰り返します。 骨髄細胞を数える マイクロ ピペットを使用して、プラスチックのパラフィン膜の部分を RBC 換散バッファーの 40 μ L を含む液滴を配置します。564Igi 骨髄管に数回を反転し、10 μ L を分注ピペットを使用して取る。RBC 換散バッファー ドロップの 40 μ L でそれをミックスします。 その後ドロップにトリパン ブルー (水溶液中で 0.4%) の 50 μ L を追加します。Burker トゥルク検定と顕微鏡下でカウント結果ミックスの 10 μ L をすぐにロードします。合計希釈倍率 × 10 を使用して mL あたりのセル数を計算します。確認十分な細胞生存率 > 90%。PA GFP 骨髄ドナー グループの 2.4 のステップを繰り返します。 ドナーの懸濁液の準備 ステップ 2.4 と受信者の希望の数で得られたカウントに基づいて、ドナー骨髄ドナー ミックス チューブに混合する 2 つのドナー グループの量を計算します。注: たとえば、1:2 の混合 564Igi:PA の 1 つのグループを設定する-6 CD45.1 受信者と GFP キメラ: 各受信者必要 20 x 106ドナー細胞の合計、1 の一部 564Igi と 2 つの部分ペンシルバニア GFP。したがって、この 6 x 1/10 x 20 x 3 を必要があります6 40 × 106 564Igi ドナー細胞および 10 x 20 x 6 x 2/3 =6 = 80 x 106 PA GFP ドナー細胞。 PA GFP および 564lgi 50 mL の円錐管に骨髄ドナーの適切な量を混ぜます。スイング バケツの回転子を使用して 10 分の 200 x gと 4 ° C で骨髄の混合物を遠心分離機します。 上清をデカントし、1 mL あたり 1 x 10 の8セルの密度で冷たい BM バッファー内細胞を再懸濁します。氷の上の冷却の 1.5 mL 遠心チューブに転送します。 骨髄骨髄ドナーと受信者を再構成 4% イソフルラン 3.75% でメンテナンスに続いて、空気中の連続的な流れを誘導を使用して受信者を麻酔します。つま先ピンチ反射の不在によって麻酔の適切な面を確認します。 慎重にはじく骨髄骨髄細胞の適切な再懸濁後骨髄ミックス (~ 10 の6セル × 20)、0.3 mL の吸引 200 μ l 添加するのにミックスを含む、30 ゲージのインスリン注射器。 その側に受信者を置き、ゆっくりと少し ‘の pop に目を目の上下の皮膚を伸ばす、ゆっくり目と周囲の組織を避けるために世話をする目のソケットの前面に約 30 ° の角度で注射器の先端を挿入します。目のソケットに下線を引く骨に触れる針の先端を感じたら、少し撤回 (~0.5 mm) とゆっくり着実に圧力を使用してドナーの骨髄を注入します。注: 必要がありますない出血、注射時に目の非常にマイナーな隆起してない流体の漏れ無し。 アドリブ抗生物質水でケージに戻すには即座に復旧手順を確認してください。受信者ごとに 2.6 のステップを繰り返します。注: 尾静脈注射は、retroorbital 注射と同様の結果の代わりに使用することができます、しかし、私たちの手でかなり遅い多数の受信者グループを操作するときの懸念があります。誤嚥や窒息のリスクをもたらすと、小径の寝具に直接麻酔動物の回復を避ける必要があります。 抗菌水切り (14 日) Cage(s) から抗生物質の水分を取り除き、新鮮な定期的な飲料水に置き換えます。 3. 成功溶解確認、キメリズム (週 6) の適切な学位を確認 Retroorbital キメラとコントロールの出血 採血管を準備するには、受信者の耳タグ番号によると遠心チューブ 1.5 mL のラベルと 5 mM EDTA を含む PBS の 50 μ L を追加します。注: 9 11 (イディオ) および CD45.2, CD45.1 PA GFP 適切なコントロールが含まれます。1 を含めることによってこれを行うことができます PA-GFP + マウス、1 CD45.1 マウス、1 B6 マウスおよび 1 564Igi マウス。 マウスを麻酔し、ステップ 2.6.1 のように麻酔の適切な面を確認します。ゆっくりと少し ‘の pop に目を目の上下の皮膚を伸ばす、その側にキメラを配置します。 目のソケットは、目および周囲の組織の損傷を避けるために世話の前面約 40 ° の角度で BoPET ラップのヘパリン キャピラリー チューブ (60 μ L 内部ボリューム) そっと挿入します。優しくひねり/チューブを回転させてそれが血液でいっぱいに開始されるまで。 受動的までほぼ完全に満ちて, 毛管によって管を埋めるために血液をできるように、チューブを撤回し、すぐにグリップに目を許可するように目の周りをリラックス同時にしながら、対応する事前ラベル コレクションの管にそれを置く元の位置に落ち着きます。出血はすぐに停止する必要があります。 コレクションの管にキャピラリー チューブを空にすることを確認し、鋭利な容器に廃棄します。管を閉じて PBS/EDTA との完全な混合を確実に 3 回を反転します。 ケージに戻すには即座に復旧手順を確認してください。各実験的マウスおよび適切なコントロールの 3.1 の手順を繰り返します。注: このメソッドが不定症照射受信者の大きなリスクをもたらす可能性がありますこれらは完全に再構成された前に、顎下静脈穿刺を使用するとき注意してください。さらに、私たちの経験で、血液量の収集、出血多量による失われた血液量はより多くの変数を見つけます。として、骨髄キメラは再構成段階で敏感な新しい骨髄が完全にしみ込んで、造血が正常なレベルを再開する前に、これらの考慮事項の両方は重要です。 末梢血単核球 (PBMC) の浄化 簡単に採血が完了した後 (10 s) 低速でチューブを遠心分離機 (< 200 x g) チューブの下部に血液を安定化、希釈を収集します。 リンパ球分離培地 10 mL 注射器を埋める、18 G 針を取り付けます。最初の管の底に針を挿入し、リンパ球分離培地 1 mL の血液サンプルを下地層します。慎重に針を撤回、次のサンプルのクロスコンタミネーションを防ぐためにペーパー タオルで拭いてください。 すべてのサンプルを続行し、低/オフ設定ブレーキと 800 × g、室温スイング バケツの遠心分離機で 25 分間遠心します。 マイクロ遠心チューブ用 BM バッファーを冷たいの 1 mL を含む対応ラベル付きの 1.5 mL のセットを準備します。 遠心分離の各サンプルでは、次の 200 μ L ピペットで上層 (プラズマ) を入力し、インターフェイス上だけ単核細胞 (MNC) 層を吸引します。1 mL の BM バッファーを含む対応ラベル付きのチューブにセルを転送します。蓋を閉めるし、ミックスに反転します。リンパ球分離培地を含む管を破棄します。 すべてのサンプルを進み 5 分、スイング バケツ ローターで 4 ° C の 200 x gで遠心分離します。吸引し、上澄みを廃棄し、冷たい BM バッファーの 200 μ L でペレットを再懸濁します。サンプルは、抗体染色やフローサイトメトリーによる解析の準備が整いました。 染色の流れフローサイト メーター評価メモ: 提案パネル: CD45.1 FITC、9 D 11 A568、CD45.2 APC B220-PerCP-Cy5.5。太平洋のオレンジ (または同等) チャネルで非アクティブ PA GFP が検出されました。リンパ球分離取得角質を取り除くと、生存性色素は不要です。 マイクロ ピペットを使用して、96 ウェル プレートに各キメラとコントロールのサンプルでは、ウェルあたり細胞懸濁液を 100 μ l 添加を追加します。 3 非 PA GFP コントロール サンプルの各サンプル (合計 300 μ L) の残りの 100 μ L をプールします。無染色のコントロールと 1 つのステンド グラス コントロール井戸のこの材料の 50 μ L を追加します。PA GFP 単一染色コントロール無染色 PA GFP サンプルの 50 μ L をさらに追加します。 各ウェルにバッファー (無染色) を 100 μ l 添加、単一の抗体 (単一染色補正のコントロール、PA GFP 補償制御を除いて) または抗体ミックス (サンプル)。氷の上 20 分間インキュベートします。 4 ° C で 5 分間 200 × gで遠心します。バッファーをフリックします。各ウェルに BM バッファーの 200 μ L を追加し、洗って再度遠心。バッファーをフリックし、BM のバッファーを 200 μ l 添加の各ウェルの細胞を再懸濁します。サンプルは、流れの cytometer (図 1) の分析の準備が整いました。注: キメラ胚中心の応答は、6 週間以降から任意の時点で分析できます。 4. 体内単一胚中心の識別を支援するためにマージナル ゾーン/被膜下洞のラベリング メモ: この議定書は足蹠/ホック (膝窩リンパ節) と (静脈、脾臓) の静脈注射のために示されるがターゲット サイトによると変えることができます。 膝窩リンパ節の分類のための二国間の足蹠注射 ステップ 2.6.1 のようにマウスを麻酔します。 1.5 mL 遠心チューブに 18 μ L の PBS、pH 7.4 で PE 標識ラット抗マウス CD169 抗体の 2 μ L を希釈します。プラスチック パラフィン フィルムの部分に混合物の 10 μ の 2 滴を配置します。30 ゲージ針で 0.3 mL インスリン注射器を用いた各液滴を吸い出しなさい。 分類のいずれかの組合せ、足蹠の 10 μ L を注入 (足蹠、つま先の初めから近位部に 5-10 ° の角度で針を入力し、かかとに向かって約中間の針を挿入) や飛節 (5-針と入力します。10 ° の角度のかかとのすぐ上と全体について挿入膝に向かう方向でアキレス腱の軸の長さの半分)。檻にマウスを戻り、手順 5 に進む前に約 15 分待ちます。 脾臓の分類のための静脈内注射 ポイント 2.6.1 のようにマウスを麻酔します。 1.5 mL 遠心チューブに PE 標識ラット抗マウス CD169 抗体 90 μ L の PBS で 10 μ L を希釈します。0.3 mL インスリン注射器で混合物を吸引します。 2.6 の手順に従って retroorbital 注射液を実行します。檻にマウスを戻り、手順 5 に進む前に約 15 分待ちます。注: イソフルラン、注射麻酔薬ケタミン ・ キシラジンのミックスを使用するように別の方法としてただし、これは一般的に回復が遅くに します。リンパ排液は一般的に骨格筋の動きによって影響を受け、これにつながる排水に時間かかります期待されます。 5. explanting 脾臓とリンパ節と photoactivation のための準備 両面のイメージングと光室の準備 20 mL の注射器からプランジャーを取り外し、背面負荷それ真空用グリース封入真空用グリースのチューブのノズルを挿入。5 mL シリンジのプランジャーを削除し、真空グリースで背中の読み込みに 20 mL の注射器を使用します。 真空グリース ロード 5 mL シリンジを使用して平らな面に正方形 coverslip を置き、真空グリース (約 1-2 mm の端から)、カバーガラスのエッジに沿ってトレース イメージングと光室を準備します。注: 微小油滴中の浸漬水で乳化真空グリースは、レンズを汚染できる真空グリースその後顕微鏡レンズと接触する任意およびすべての表面の汚染を避けるために注意してください。 冷たい BM バッファーとカバー スリップ真空グリース溜まりを埋めるし、冷たい平らな面に置きます。 リンパ節と脾臓の収穫 生体内で 2.2.1 の手順に従って分析されるキメラマウスをラベルを安楽死させます。70% エタノールで枝肉をスプレーします。 膝窩リンパ節微細直線はさみを使用して、ちょうど膝ピット下の皮膚に切開を行い、股関節までほぼハムスト リング ラインに沿って上向きにカットを拡張します。デュモン #5 または #7 鉗子を使って皮膚外側、膝窩 (図 2 a) で組織を公開するための公開されたフラップのそれぞれを引き出します。 慎重に膝窩静脈にちょうど内側膝窩を入力し、解剖・ デュモン #5 ピンセットのペアを使用して、基になる膝窩リンパ節を公開するために、脚の軸に沿って鉗子を挿入して開いたり閉じたりして脂肪を開きます。 フロント側の親指と人差し指 (図 2 b) を使って膝に近位の大腿四頭筋をつまんで窩のリンパ節を開きます。リンパ節を周囲の組織 (図 2) からそれを解放して、5.1 準備した真空グリース溜まりに配置する鉗子で下からつかみます。 5.2.2-側の 5.2.4 の手順を繰り返します。複数のリンパ節は、必要な場合単室で合うことができます。 最後に真空用グリースの縁の上に 2 番目の coverslip を配置し、すべての気泡を押し出すように注意しながら、そっと押す商工会議所を閉じます。注: バッファーのいくつかは同様に、押し出されることがありますが、真空グリースは、(図 2 D) 流体の漏れを防止する、タイトなシールを形作るべきであります。リンパ節は、両面のイメージング商工会議所にされます。 マウス、前内側線に近位の左側腹壁切開微細直線はさみ作るのペアを使用して、脾臓胸郭の真下、後腋窩線を体の周りにそれを拡張します。脾臓のヒントが表示されます (図 3 a) をする必要があります。 デュモン #7 鉗子のペアで脾臓を抜くし、それを解放する下側の癒着をカットします。~ 2 ミリメートルの厚さ、断面、スライスを削減するのに微細直線のはさみのペアを使用します。 5.1 準備した真空グリース溜まりにスライスを配置します。複数の脾臓スライスは、必要な場合単室で合うことができます。 最後に真空用グリースの縁の上に 2 番目の coverslip を配置し、すべての気泡を押し出すように注意しながら、そっと押す商工会議所を閉じます。イメージングと光の間を除いてすべての回で氷の上すべてのイメージング室を保ちます。注: バッファーのいくつかは同様に、押し出されることがありますが、真空グリースは流体の漏れを防止する、タイトなシールを形作るべきであります。脾臓のスライスが両面のイメージング室 (図 3 b) です。 6. 光 単一の胚中心を識別します。メモ: このプロトコルについては, 脾臓が、リンパ節を完全に似ています。 顕微鏡ステージ上イメージングのチャンバーを配置します。3.5 mL プラスチック転送ピペットを使用して、上部の coverslip の上に水の滴を配置し、の接点まで目的を下げます。透過光を使用してティッシュの上に焦点を当てます。 暗いモードと 2 光子励起に切り替えるし、940 にレーザーを調整 nm。注: 適切なフィルター セットを持つこの波長励起と許可 4.2 の手順で注入 CD169 PE と同様、主要な船舶や構造要素に関連付けられたコラーゲンを含む構造の第二高調波発生の検出を辺縁帯を識別します。しかし、940 nm 励起はない photoactivate PA GFP をしません。 組織の表面の近くの (CD169 PE の汚損によって区切られた) 個々 の白いパルプ領域をローカライズし、中央動脈に関連付けられている第 2 高調波発生による periarteriolar リンパ鞘 (仲間、T 細胞ゾーン) を識別します。仲間と辺縁帯のゾーンで見て高い蛍光の存在有効な核体マクロファージ (すべてのチャンネルで強い蛍光信号、暗い空胞を持つ blob のような外観) (図 4 a)。注: 必要に応じて、組織の望ましくない方向のため、イメージングの商工会議所を反転することができ、イメージングを他の方向から実行できます。 6.1.3 の手順で特定の特徴に基づいて。、単一胚中心領域の特定の関心の領域を描画します。周りの Z スタックを設定 100-150 μ m 深さ、〜 3 μ m のステップ サイズを使用して、組織の面から開始。 励起波長 830 nm に切り替えます。オフにシャット ダウンまたは探知器に光損傷を防ぐためにすべてのチャンネルを暗く (としてレーザー電源と出力蛍光がこの波長で劇的に高い通常) し、スタックを ‘画像’。注: レーザー パワーとピクセル滞留時間など、特定の設定は、組織、特定の組織が使用すると、イメージング システムの深さに依存します。各アプリケーションは、使用される特定のイメージング システムの最適化するようにしました。スタック全体の効率的な光を得るために不可欠ですが、注意が必要に光損傷セル。 励起波長 940 nm に戻り、チャンネルを再度開きます。(図 4 b) を通して効率的な光と光損傷 (びまん性、非セル限定 PA gfp、暗い斑点やセンサー領域で高度蛍光) の不在を確認するスタックをスキャンできます。 イメージング室ですべての関連する組織 photoactivate に進みますし、速やかにさらなる処理まで氷にそれを返します。追加撮像室の photoactivation を続行します。注: 組織 explanting、取付および特に photoactivation、時間のかかるプロセスが、合計所要時間が 4-6 時間、細胞生存率の劇的な減少を防ぐために制限されます。 7. 回復とセンサー細胞の解析 リンパ球のリンパ節および脾臓から抽出 各センサーのサンプルでは、氷の上 BM バッファーの 500 μ L を含むそれに応じてラベル付き 1.5 mL 遠心チューブを準備します。非 PA GFP コントロールと非活性化 PA GFP マウスのサンプルが含まれます。B6 コントロールは 1 つと 1 つの PA GFP コントロール マウスを含めることによってこれを実現できます。 イメージングの商工会議所は、(存在する場合は、複数のサンプルが単一の商工会議所の存在)、サンプルの位置を維持し、それぞれのサンプル チューブに各サンプルの世話から上部のカバー スリップを慎重に取り外します。 杵ホモジナイザーを使用すると、組織を絞るし、リンパ球をリリースする管で杵をねじる。マイクロ ピペットを使用して、ライセートを吸引し、新鮮な予冷 1.5 mL 遠心チューブに 70 μ m セル ストレーナー フィルターします。リンパ節のサンプル手順 7.1.5 に進みます。 脾臓サンプル 200 x gスイング バケツ ローターの 4 ° C で 5 分間遠心します。上澄みを廃棄し、RBC 換散バッファーの 200 μ L でペレットを再懸濁します。、室温で 5 分間インキュベートし、冷えた BM バッファーの 800 μ l 添加し 7.1.5 のステップへ進みます。 200 x gスイング バケツ ローターの 4 ° C で 5 分間遠心します。上澄みを廃棄し、冷えた BM バッファーの 200 μ L で再懸濁します。必要な場合にも、サンプルは流れフローサイトメトリー評価のために汚れると並べ替えの準備が整いました。 染色の流れフローサイト メーター評価注: パネルを提案した: CD169 PE, B220 PerCP Cy5.5, 9 D 11-A647、CD38 PE Cy7、修正可能性色素 Efluor-780、GL7 パシフィック ブルー。太平洋のオレンジ (または同等) チャネルで非アクティブ PA GFP が検出されました。GFP チャネルでセンサー PA GFP が検出されました。(これは可能性がありますまたは可能性がありますされていない体内 CD169 PE の付いた) 任意の共同精製マクロファージは、CD169 PE で染色とダンプ ゲートとしてこれを使用して除外できます。 マイクロ ピペットを使用して、96 ウェル プレートでの各キメラとコントロールのサンプルでは、ウェルあたり細胞懸濁液 100 μ L を追加します。 B6 コントロールのサンプル、この素材無染色のコントロールと 1 つのステンド グラス コントロール井戸を 50 μ L を追加します。アクティブ化されていない PA GFP 単一染色コントロール無染色非アクティブ PA GFP サンプルの 50 μ L をさらに追加します。アクティブ PA GFP の単一染色のコントロールを使用すると、すべてのセンサーのサンプルの残りの材料をプールします。 各さて、バッファー (無染色し、PA GFP 補償制御) を 100 μ l 添加、単一の抗体 (単一染色補正コントロール) または抗体ミックス (センサーのサンプル)。氷の上 20 分間インキュベートします。 200 × gで遠心分離機の 4 ° C で 5 分間バッファーをフリックします。各ウェルに BM バッファーの 200 μ L を追加し、洗って再度遠心。バッファーをフリックし、BM のバッファーを 200 μ l 添加の各ウェルの細胞を再懸濁します。サンプルは、流れの cytometer またはソーター (図 5に代表的な結果) の分析の準備が整いました。