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Biochimie

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Published: September 05, 2019
doi:
10.3791/59387
,
1Department of Chemistry,University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics,University of Virginia School of Medicine

Summary

3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

Abstract

단 하나 분자 현지화 현미경 검사법은 수십 나노미터 공간 및 밀리초 측두력 해결책으로 살아있는 세포에 있는 개별 분자의 위치 그리고 운동을 조사합니다. 이러한 기능은 생리학적으로 관련된 환경에서 분자 수준의 생물학적 기능을 연구하는 데 이상적으로 적합한 단일 분자 국소화 현미경 검사법을 만듭니다. 여기서, 우리는 관심 있는 단백질이 나타낼 수 있는 상이한 확산 상태를 추출하기 위해 단일 분자 추적 데이터의 획득 및 처리/분석을 위한 통합 프로토콜을 입증한다. 이 정보는 살아있는 세포에 있는 분자 복합체 대형을 정량화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 우리는 카메라 기반의 3D 단일 분자 국소화 실험뿐만 아니라 개별 분자의 궤적을 산출하는 후속 데이터 처리 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 궤적은 형광표지된 분자및 이 상태의 상대적인 풍부의 널리 퍼진 확산 상태를 추출하기 위하여 수치 분석 프레임워크를 사용하여 분석됩니다. 분석 프레임워크는 임의의 셀 기하학에 의해 공간적으로 제한된 세포 내 브라우니안 확산 궤적의 스토시 시뮬레이션을 기반으로 합니다. 시뮬레이션된 궤적을 기반으로 원시 단일 분자 이미지가 실험 이미지와 동일한 방식으로 생성되고 분석됩니다. 이러한 방식으로 실험적으로 교정하기 어려운 실험 정밀도와 정확도 제한은 해석 워크플로우에 명시적으로 통합됩니다. 널리 사용되는 확산 상태의 확산 계수 및 상대 모집단 분율은 시뮬레이션된 분포의 선형 조합을 사용하여 실험 값의 분포를 피팅하여 결정됩니다. 우리는 세균성 병원체의 시토솔에서 호모- 및 이종 올리고머 복합체를 형성할 때 다른 확산 상태를 나타내는 단백질의 확산 상태를 해결함으로써 프로토콜의 유용성을 입증합니다.

Introduction

생체 분자의 확산 거동을 검사하면 생물학적 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 형광 현미경 검사법 기반 기술은 그들의 모국적인 세포 환경에서 생체 분자를 관찰하기위한 귀중한 도구가되었습니다. 광표백(FRAP) 및 형광 상관분광법(FCS)1 후형광 회복은 앙상블 평균 확산 거동을 제공합니다. 반대로, 단 하나 분자 현지화 현미경 검사법은 높은 공간 및 시간분해능을가진 개별형질 표를 붙인 분자의 관찰을 가능하게 합니다2,3,4. 관심 있는 단백질이 다른 확산 상태에 존재할 수 있기 때문에 개별 분자를 관찰하는 것은 유리합니다. 예를 들어, 대장균의CueR과 같은 전사 조절기가 시토솔에서 자유롭게 확산되거나 DNA 서열에 결합하여 측정 시간 척도에 고정될 때 두 가지 쉽게 구별할 수 있는 확산 상태가발생합니다 5 . 단일 분자 추적은 이러한 서로 다른 상태를 직접 관찰하기 위한 도구를 제공하며 이를 해결하기 위해 정교한 분석이 필요하지 않습니다. 그러나, 그들의 확산 비율이 더 유사한 경우에 다중 확산 상태 및 그들의 인구 분수를 해결하는 것이 더 어려워집니다. 예를 들어, 확산 계수의 크기 의존성으로 인해, 단백질의 상이한 올리고머화 상태는 상이한 확산 상태6,7,8,9로 나타난다. , 10. 이러한 경우 데이터 수집, 처리 및 분석 측면에서 통합 된 접근 방식이 필요합니다.

세포질 분자의 확산 속도에 영향을 미치는 중요한 요소는 세포 경계에 의한 감금의 효과입니다. 세균 세포 경계에 의한 분자 운동에 대한 제한으로 인해 세포 분자의 측정된 확산 속도가 제한된 공간에서 동일한 움직임이 발생한 경우보다 느리게 나타납니다. 매우 천천히 확산 되는 분자에 대 한, 세포 감금의 효과 경계와 충돌의 부족으로 인해 무시할 수 있다. 이러한 경우 Brownian 모션 방정식에 기반한 분석 모델을 사용하여 분자 변위, r또는 명백한 확산 계수 D*의분포를 피팅하여 확산 상태를 정확하게 해결할 수 있습니다. 임의 확산)11,12,13. 그러나, 빠른 확산 cytosolic 분자를 위해, 실험 분포는 더 이상 세포 경계와 확산 분자의 충돌 때문에 제한되지 않은 Brownian 운동을 위해 얻은 것과 유사하지 않습니다. 감금 효과는 형광표지된 분자의 제한되지 않은 확산 계수를 정확하게 결정하기 위해 고려되어야 한다. 몬테카를로 시뮬레이션을 통해 (반)5, 14,15,16 또는 수치학적으로 감금 효과를 설명하기 위해 최근 여러 가지 접근법이 개발되었습니다. 브라우니안 확산6,10,16,17,18,19.

여기에서는 단일 분자 추적에 중점을 둔 단일 분자 국소화 현미경 데이터를 수집하고 분석하기 위한 통합 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 최종 목표는 형광 표지된 세포질 단백질의 확산 상태를 해결하는 것입니다.이 경우, 막대 모양의 세균 세포. 우리의 연구는 DNA 중합효소, PolI가 확산 분석20에의해 DNA 결합 및 언바운드 상태로 존재하는 것으로 나타난 단일 분자 추적을 위한 이전 프로토콜을 기반으로 합니다. 여기서는 단일 분자 추적 분석을 3D 측정으로 확장하고 보다 현실적인 계산 시뮬레이션을 수행하여 세포에 동시에 존재하는 여러 확산 상태를 해결하고 정량화합니다. 데이터는 이중 나선 점 확산 기능(DHPSF)21,22를사용하여 이미징을 통해 형광 방출기의 3D 위치를 결정할 수 있는 가정용 3D 초고해상도 형광 현미경을 사용하여 수집됩니다. 원시 단일 분자 이미지는 사용자 정의 작성 소프트웨어를 사용하여 3D 단일 분자 국소화를 추출한 다음 단일 분자 궤적으로 결합됩니다. 수천 개의 궤적이 풀려져 명백한 확산 계수의 분포를 생성합니다. 마지막 단계에서 실험 분포는 몬테카를로 모션의 몬테카를로 시뮬레이션을 통해 얻은 수치로 생성된 분포와 제한된 볼륨으로 적합합니다. 우리는 살아있는 Yersinia enterocolitica에있는 타입 3 분비 시스템 단백질 YscQ의 확산 상태를 해결하기 위하여 이 프로토콜을 적용합니다. 모듈식 특성으로 인해 당사의 프로토콜은 일반적으로 임의의 세포 기하학적 구조에서 모든 유형의 단일 분자 또는 단일 입자 추적 실험에 적용할 수 있습니다.

Protocol

1. 이중 나선 점 확산 기능 교정 참고: 이에 기재된 이미지 및 이하의 섹션은 Rocha 등23에기재된 바와 같이 맞춤형 거꾸로 된 형광 현미경을 사용하여 획득된다. 동일한 절차는 단일 분자 국소화 및 추적 현미경 검사법2,3,4를 위해 설계된 다른 현미경 구현에 적용 할 수있습니다. 이 문서에 설…

Representative Results

여기에 설명된 실험 조건(20,000프레임, 최소 4개의 국소화)과 형광 표지된 융합 단백질의 발현 수준에 따라 약 200-3,000개의 국소화가 10-150개 궤적은 셀당 생성될 수있습니다(그림 2a,b). 명백한 확산 계수의 잘 샘플링된 분포를 생성하려면 많은 수의 궤적이 필요합니다. 여기서 수집된 FOV의 크기는 ~55 x 55 μm이며, 실험당 10개의 FOV가 수집됩?…

Discussion

제시된 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 중요한 요소는 단일 분자 신호가 서로 잘 분리되도록 하는 것입니다(즉, 공간과 시간에 희소해야합니다(보충 Mov.1)). 세포에 동시에 하나 이상의 형광 분자가 있는 경우, 국소화는 다른 분자의 궤적에 잘못 할당될 수 있습니다. 이를 링크 문제30이라고합니다. 단백질 발현 수준 및 여기 레이저 강도와 같은 실험 조건은 연결 문…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

알레시아 아치모비치와 팅 얀에게 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 버지니아 대학의 고급 연구 컴퓨팅 서비스 그룹의 선임 직원 인 Ed Hall에게 이 작업에 사용되는 최적화 루틴을 설정하는 데 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작업에 대한 자금은 버지니아 대학에 의해 제공되었다.

Materials

2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.
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Citer Cet Article
Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).
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