单分子跟踪显微镜 - 确定细胞分子扩散状态的工具

研究生物分子的扩散行为可以深入了解其生物功能。基于荧光显微镜的技术已成为观察其原生细胞环境中的生物分子的宝贵工具。光漂白 （FRAP） 和荧光相关光谱 （FCS）¹之后的荧光恢复提供整体平均扩散行为。相反，单分子定位显微镜能够观察具有高空间和时间^{分辨率2、3、4}的单个荧光标记分子。观察单个分子是有利的，因为感兴趣的蛋白质可能存在于不同的扩散状态。例如，当转录调节器（如大肠杆菌中的 CueR）在细胞醇中自由扩散或与DNA序列结合，并在测量时间尺度上固定时，会出现两种易于区分的扩散状态。.单分子跟踪为直接观察这些不同状态提供了工具，并且不需要复杂的分析来解析它们。然而，在扩散率更相似的情况下，解决多种扩散状态及其人口分数就变得更加困难。例如，由于扩散系数的大小依赖性，蛋白质的不同寡聚状态表现为不同的扩散状态^{6、7、8、9,10.}这类案件需要在数据采集、处理和分析方面采取综合办法。

影响细胞分子扩散率的一个关键因素是细胞边界约束的影响。细菌细胞边界对分子运动的限制导致细胞分子的测量扩散速率看起来比在未封闭空间中发生相同运动时要慢。对于非常缓慢的扩散分子，由于没有与边界碰撞，细胞禁闭的影响可以忽略不计。在这种情况下，可以使用基于布朗运动方程的分析模型，通过拟合分子位移、r或表观扩散系数D+的分布，可以准确求解扩散状态（随机扩散）^11，12，13。然而，对于快速扩散的细胞分子，由于扩散分子与细胞边界的碰撞，实验分布不再类似于未限制的布朗运动。必须考虑约束效应，以准确确定荧光标记分子的未封闭扩散系数。最近已经开发出几种方法，通过蒙特卡罗模拟，从分析上^{解释5、14、15、16}或数字的禁闭效果。布朗扩散6，10，16，17，18，19。

在这里，我们提供一个集成协议，用于收集和分析单分子定位显微镜数据，特别注重单分子跟踪。该协议的最终目标是解决荧光标记的细胞蛋白内部（本例中为棒状细菌细胞）的扩散状态。我们的工作建立在以前的单分子跟踪协议之上，其中DNA聚合酶PolI通过扩散^分析20证明存在于DNA结合和未结合状态。在这里，我们将单分子跟踪分析扩展到 3D 测量，并执行更逼真的计算模拟，以解决和量化同时存在于细胞中的多种扩散状态。这些数据是使用自制3D超分辨率荧光显微镜获取的，该显微镜能够通过双螺旋点扩散功能（DHPSF）21、22的成像来确定荧光发射器的3D位置。使用定制软件处理原始单分子图像，提取 3D 单分子定位，然后组合成单分子轨迹。数千个轨迹被汇集在一起，以产生表观扩散系数的分布。在最后一步中，实验分布与通过蒙特卡洛模拟布朗运动在密闭体积中获得的数值生成的分布相得一拟。我们应用这个协议来解决3型分泌系统蛋白YscQ在活叶尔西尼亚肠胆病中扩散状态。由于其模块化性质，我们的协议通常适用于任意细胞几何结构中的任何类型的单分子或单粒子跟踪实验。