Gene uttrykk i pattedyrceller er tett og dynamisk regulert, og transkripsjon er en av de viktigste trinnene. Gene transkripsjon er hovedsakelig regulert av transkripsjon faktorer og histoner. En transkripsjon faktor er et protein som binder seg til bestemte DNA-sekvenser og styrer genet transkripsjon. Disse faktorene enten fremme eller hemme rekrutteringen av RNA polymerase II (PolII), som initierer mRNA syntese fra genomisk DNA som en mal¹. Histone modifikasjoner som acetylering og metylering av histone hale rester positivt og negativt påvirke genet transkripsjon ved å endre kromatin struktur². Siden endringer i genet uttrykk påvirker mobilnettet sammenheng, er det viktig å undersøke den molekylære mekanismer som transkripsjon er regulert.

Hittil flere metoder for å undersøke regulering av genet transkripsjon er tilgjengelig. Elektroforetiske mobilitet Shift-analysen (EMSA), også kalt en gel-Shift-analysen, brukes til å analysere en protein-DNA interaksjon³. Et kjernefysisk ekstrakt fra celler av interesse er inkubert med en radioaktiv isotop (for eksempel ³²P)-merket DNA-sonde og electrophoresed på en polyakrylamid gel. Dens autoradiogram viser at DNA-proteinet komplekset migrerer saktere enn sonden i en gel. I nærvær av et antistoff mot proteinet migrerer DNA-protein-antistoff-komplekset i en gel saktere enn DNA-proteinet. Dette supershifted bandet avslører spesifikk binding mellom DNA og protein. Imidlertid, EMSA bare bestemmer en spesifikk DNA-protein vekselvirkningen inne en cellen-ledig system, og derfor den restene ubekjent hvorvidt samspillet kontroller transkripsjon inne leverceller. Den forbigående reporter analysen, ofte kalt luciferase reporter analysen, ble utviklet for å ta genuttrykk regulering i cellene. Vanligvis en oppstrøms genomisk regionen av et gen av interesse er satt inn i en reporter plasmider, midlertidig transfekterte i celler, og reporteren aktiviteten måles. En rekke sletting mutanter tillater identifisering av regioner som er ansvarlig for gen regulering. Selv om en reporter analysen er et nyttig verktøy for å identifisere transkripsjon faktorer og bindende DNA-sekvenser kontrollerende transkripsjon, har denne metoden en stor ulempe i at en reporter plasmider er fri for kromatin struktur og reflekterer ikke “ekte” transkripsjon maskiner. I tillegg kan ikke endringer i histone endringer bestemmes av systemet.

Utviklingen av kromatin immunutfelling (ChIP) metoden var basert på Jackson og Chalkley ‘ s rapporter om at “hele cellen” fiksering med formaldehyd bevarte kromatin struktur^4,5. Siden da har mange relaterte teknikker er utviklet og forbedret⁶. I ChIP analyser, celler er festet med formaldehyd å kryss-link DNA og proteiner. Kromatin er fragmentert og deretter immunoprecipitated med antistoffer av interesse. Immun komplekset er vasket, og DNA er renset. PCR forsterkning med grunning rettet mot en bestemt region av Genova avslører belegg av proteiner av interesse i Genova.

Selv om ChIP er et kraftig verktøy for å identifisere interaksjoner av proteiner som transkripsjon faktorer og modifisert histoner med DNA, innebærer metoden noen vanskeligheter, for eksempel en kromatin fragmentering trinn, i praksis. Sonikering har vært mye brukt for klipping kromatin; Det er imidlertid tungvint å identifisere reproduserbar forhold. Micrococcal nuklease (MNase) behandling er en alternativ metode for kromatin klipping. MNase er en Endo-exonuclease som fordøyer dobbel-strandet, enkelt-strandet, sirkulær og lineær DNA og RNA. Det er relativt enkelt å bestemme forholdene, inkludert mengder av kromatin og enzym, temperatur og inkubasjonstid, for optimal kromatin fragmentering. Vi endret og forenklet eksisterende protokoller, og vi etablerte en grei og reproduserbar metode. Dette papiret gir protokollen for en ChIP-analysen ved hjelp MNase i pattedyrceller.