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Immunologie et infection

생리 적 면역 원 성 수지상 세포 생성을 위한 새로운 프로토콜

Published: May 17, 2019
doi:
10.3791/59370
, , , , , , , , , , ,
1Department of Dermatology,Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department,University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology,Yale University School of Medicine

Summary

체 외 광 화학요법 (ECP)의 핵심 기능을 복제 하기 위해 실험 설정에서 생리 활성, 가변 수지상 생산을 가능 하 게 하는 (TI) 장치 또는 플레이트 및 관련 프로토콜이 개발 되었습니다. 암 면역 요법을 위한 세포 (DCs).

Abstract

체 외 광 화학요법 (ECP)은 전 세계적으로 350 개 이상의 대학 센터에서 작동 하는 피부 T 세포 림프 종 (CTCL)을 위한 널리 사용 되는 암 면역 요법입니다. ECP의 임상 효능과 모범적인 안전 프로 파일은 광범위 한 사용을 주도하 고 있지만, 근본적인 메커니즘의 해명을 유지 하는 것은 실험실 ECP 모델의 부족으로 인해 부분적으로도 여전히 문제가 남아 있습니다. 이러한 장애물을 극복 하 고, ECP 연구를 위한 간단 하 고 사용자 친화적인 플랫폼을 만들기 위해 우리는 마우스 모델과 작은 인간 혈액 샘플을 모두 사용 하는 작업에 적합 한 임상적으로는 검 측 백혈구 처리 장치의 축소 버전을 개발 했습니다. 이 장치는 트랜스 임피던스 화 (TI) 챔버 또는 플레이트 라고 불립니다. 일련의 획기적인 실험에서, 소형화 된 장치는 여러 신 유전학 마우스 종양 모델에서 치료 적 항 암 면역성을 규칙적으로 개시 하는 세포 백신을 생산 하는 데 사용 되었다. 실험 시스템에서 개별 요인을 제거 하 고 생체 내 항 종양 반응에 대 한 기여도를 나서야, 우리는 잠재적 인 ECP의 핵심 기계 운전 동인을 해명 합니다. 집합적으로, 우리의 결과는 ECP의 항 종양 효과가 수지상 세포 (DC)에 의해 시작 되는 것을 밝혀 냈으 며,이는 생리학적으로 티 플레이트에서 혈소판과 혈액 단 핵 상호 작용을 통해 생성 되 고 종양 세포의 사 멸 세포에서 항 원을 로드 사 멸은 광 활성화 가능한 DNA가 교제에 노출에 의해 미세 하 게 적정 되며 8-methoxypsoralen 및 UVA 광 (8-MOPA) 이다. 마우스에 반환 될 때,이 세포 백신 특정 하 고 양도 항 종양 T 세포 면역에 이르게. 우리는 TI 챔버가 인간 혈액 처리에도 적합 하다는 것을 확인 하였으며,이를 통해 인간 DCs는 활성 상태와 프로 파일에 완전히 필적 하는 것으로 임상적 인 ECP 챔버 로부터 유래한 것 이다. 여기에 제시 된 프로토콜은 마우스와 man에 있는 ECP 연구를 위한 것이 고, 8 개의 MOPa를 가진 사 멸 종양 세포의 통제 된 생성, 그리고 다양 한 신청을 위한 생리 적인 인간적 인 및 마우스 단 핵 유래 DCs의 급속 한 생산을 위한 것입니다.

Introduction

체 외 광 화학요법 (ECP)은 전세계적으로 대학 센터에서 널리 작용 하는 확립 된 면역 요법입니다. 그 사용은 ecp 요법의 고유한 선택성, 안전성 및 양방향 효능에 의해 주도 되었으며, ECP가 파트너에 게 나타나는 생리 적 면역 체계 자체와 공유 하는 특성입니다. ECP는 피부 T 세포 림프 종 (ctcl)의 악성 세포에 대해 선택적으로면역 화 하 고 이식, 자가 면역 및 이식 편대 숙주 질환 (gvhd) 설정에서 표적화 된 항 원을 선택적으로 내성 3 , 4. ecp의 면역 원 성은 ctcl5의 손상 되지 않은 CD8 T 세포 구획에 의존 하 여 강조 표시 되는 반면 특이성은 ecp의 매우 유리한 부작용 프로 파일에 의해 반영 되지만 이식 시에는 오프 타겟 면역 억제가 없습니다. GvHD 설정, 그리고 CTCL에서 증가 된 기회 감염 감수 성은 없으며, 여기서 비 병원 성 T 세포 클론은 악성 T 세포와 함께 잠재적으로 손실 될 수 있다.

ECP의 임상적 중요성을 감안할 때, 그 메커니즘의 더 나은 이해가 암의 더 넓은 스펙트럼에 ECP의 치료 도달 범위를 확장 할 수 있습니다 및 면역 장애는 국제적인 관심을 자극 하고있다. 국가 공인 워크샵 2 개, 국립 보건 학회 (NIH) 과학 심포지엄6 및 사회 공헌 대회7에 대 한 미국 학회를 실시 하 고 보고, 가속의 목표와 ECP에 대 한 주요 셀룰러 기여자의 확인 항 암 및 토로 제 닉 효과.

지금까지 많은 게시 된 보고서에서 ECP 메커니즘을 해결 하려고 시도 했음에도 불구 하 고 두 가지 주요 장애물은 과학적 진보를 방해 했습니다. 첫째, 실험적 실험실 설정에서 ECP 메커니즘에 대 한 조사는 ECP의 셀룰러 및 생체 내 효과를 완전히 반영 하 고 동물 모델에 적용 될 수 있는 소형 ECP 장치의 부족에 의해 제한 되었습니다. 둘째, 임상 설정에서 ECP 샘플에 대 한 심층 연구소 분석은 ECP가 제한적으로 사용할 수 있도록 제한 되어 있으며,이는 치료 센터에 대 한 접근이 필요 하며, 추가적으로 타이밍에 따라 환자의 주입, 그리고 환자-재 주입 된 백혈구의 타협 세트에 대 한 윤리적 필요.

ECP 연구의 진행을 방해 하는 장애물을 해결 하기 위해, 우리는 가장 밀접 하 게 치료의 핵심 요소를 모방 하는 소형 ECP 장치를 개발 하기 위해 밖으로 설정. 표준 ECP 치료는 1 mm 두께의 자외선 a 광 (UVA) 투명 플라스틱 플레이트6을통해 환자의 백혈구가 풍부한 백혈구의 통과를 수반 합니다. 판에서 백혈구는 8 methoxypsoralen (8-MOP)에 노출 되며, UVA 노출 시에는 반응 형 (8-MOPa)으로 일시적으로 변환 되 고 피리 미 딘 염기에 대 한이의 결합을 통해 DNA 가교를 할 수 있는 광 활성 제입니다. DNA 가닥9,10. 처리 된 8-MOP 처리된백혈구는 환자에 게 정 맥 내로 회수 되 고 반환 됩니다.

ECP 자체는 양방향 치료법으로 암에 면역이 되 고 이식, 자기 면역 및 GvHD 설정에서의 내성이 있기 때문에 우리는 모델 ECP의 면역 모드 “트랜스 임피던스”와 tolerogenic 제 닉 모드 “트랜스 스 톨 화” 라고 명명 했습니다. 우리는 먼저 트랜스 임피던스 형식에 초점을 맞추고 있습니다. 최근 보고 된 소형화 가능한 마우스-man ECP 장치, 트랜스 임피던스 화 (TI) 챔버 또는 플레이트와 대응 하는 프로토콜은 암 설정11에서 인체 ECP 장치의 세포 및 생체 내 효과를 모두 재현 한다.

임상적으로 관련성이 있는 생체 모델에서의 트랜스 임피던스 화를 만들기 위하여, 우리는 피하 주사 된 신 유전학 마우스 종양이 만져 진 후에 면역 요법을 개시 하였으며, 따라서 확립 된 암에서의 프로토콜의 효능을 시험 하였다. CTCL의 ECP와 마찬가지로 흑색 종의 YUMM 1.7 모델에서의 원리 증명 트랜스 임피던스 화 프로토콜은 종양-베어링 동물 로부터 말 초 혈액 단 핵 세포 (PBMC)를 사용 합니다. 세포는 흐름 하에서 TI 플레이트를 통해 전달 됩니다. 8-MOP가 소형 챔버에서 세포를 처리 하는 것이 가능 하면서, 원하는 세포 형만이 8-mop에 노출 되도록 하기 위해 별도로 수행 하는 것이 바람직하다. 초기 연구 결과는 ECP가 8-MOP-부상 항 원 제시 세포 (12)에 의해 조절 되는 반면, 면역 화 효과는 표적 종양 세포 (11)의 부상으로 8-mop를 요구 한다는 것을 나타낸다. 트랜스 임피던스 화 프로토콜에서 종양 세포 또는 면역 세포 중 어느 것이 든 필요에 따라 8-MOPA 에 선택적으로 노출 될 수 있다. 8-MOP-부 상당한 종양 세포와 ECP를 유도 한수지상 세포 (DC)의 접촉 시간을 최대화 하기 때문에 임상 ecp13의 면역 요법 용량을 현저히 향상 시키는 것으로 나타났습니다 우리의 프로토콜에 공동 인큐베이션 단계. 밤새 배양 후, 처리 된 세포는 종양 담지 동물에 게 반송 된다.

이 시스템은 안정적으로 종양 성장을 감소 하 고 확립 된 신 유전학 종양 (11)을 가진 쥐에서 특정 항 종양 면역성을 개시 하 고, ECP의 임상 항 종양 효능의 메커니즘을 분석할 수 있게 하였다. 여러 연구에서 우리는 ECP 내성이 TI 플레이트 (14,15)에서의 생체 내 혈소판 활성화를 통해 개시 된다는 것을 입증 하였다. 활성화 된 혈소판은 이후 단 핵-수지상 세포 성숙 (14)을 신호 하 여 생리 적 DCs의 생산을 유도 한다. 새롭게 형성 된 모노 이트 유래 DCs는 8-걸 레 A-손상된종양 세포 로부터 내 면화 된 항 원을 교차-항 원 특이 적 T 세포 반응을 활성화 시킬 수 있다 (16). 그러나 이전12,17에 제안된것 처럼, 초기 dc 자체의 8-MOP의 유도 손상은 ECP 허용 오차에 대 한 기계적 링크를 제공 하는 항 종양 효과 (11)를 반대 행동 또는 반전 할 수 있습니다.

TI 플레이트는 또한 인간 PBMC 로부터 생리 활성 DCs를 생산 하는 데 사용 되었습니다. 마우스 연구와 유사 하 게, 인간 TI 유래 DCs는 그들의 세대에 대 한 혈소판의 존재 하에 판 통로에 의존 하 고, 임상적 인 ECP 판에서 생성 된 것과 전형적으로 동일한 것으로 나타나며, 효율적으로 처리 될 수 있고 인간의 T 세포의 활성화를 위한 인간 종양 항 원을 교차 제시11,16.

ECP 면역 요법의 메커니즘을 잠복에서, 우리는 따라서, 기능적으로 변조 될 수 있는 원하는 항 원 특이성의 생리 적 마우스 및 인간 수지상 세포를 신속 하 게 생성 하는 방법을 밝혀 냈다. 혁신적인 TI 장치 및 프로토콜은 ECP 연구 및 치료 및 암 면역 요법 분야에서 더 광범위 하 게, 그리고 생리 적, 기능적 수지상 세포 중 어느 하나에 대 한 관심을 가진 다른 분야에서 상당한 잠재적 중요성을가지고 면역 화 또는 내성 모달. 우리는이 출판물은 이러한 연구 분야에 관심이 있는 사람들에 게 필요한 도구를 제공 할 것입니다 바랍니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 마우스 방법은 동물 의료 지침의 국립 연구소와 계약, 예일 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다. 모든 인간 연구는 건강 한 지원자에 의해 기증 된 혈액으로 수행 되었다, 서 면 정보에 동의. 인간의 혈액 연구는 인정 된 윤리적 지침 (예: 헬싱키, CIOMS, 벨몬트 리포트, 미국 공통 규칙)에 따라 진행 되었으며, 프로토콜 번호 0301023636에 따라 예일 휴먼 시험용 심사 위원회에 의해 승인 되었습니다. 참고: 다음은 마우스 신 유전학 종양의 항 종양 치료를 위한 트랜스 임피던스 화를 설명 하는 프로토콜 이다. 1. 신 제네 믹 유 MM 1.7 종양 이식 확립 된 프로토콜에 따라 종양 세포 라인에 적절 하 게 적합 한 마우스의 측면으로 신 유전학 종양을 이식 한다.참고: 아래 프로토콜은 YUMM 1.7 C57BL/6 마우스 흑색 종 종양 모형을 기술 합니다. YUMM 1.7 흑색 종 세포는 친절 하 게 예일18박사 보 센 버그에 의해 제공 되었다. 한 세포 통로 후에 세포를 냉동 하 여 동결 해제 하 고 전지를 사용 한다. 문화-Dulbecco의 수정 된 독수리의 영양 혼합물 DMEM 배지 (FBS), 1% 페니실린/streptomycin 및 1% 비 필수 아미노산으로 보충 되는 덜 벡 코의 변형 된 YUMM 1.7 세포는 표준에 따라 조직 배양 조건 (37 ° c, 5%co2). 세포 배양 접시 또는 플라스 크 (예컨대, T75 플라스 크에 대 한 4 mL)의 바닥을 커버 하기에 충분 한 트립 신-EDTA를 첨가 하 여 60 \ u201270%의 합류에서 YUMM 1.7 세포를 수집 한다. 실 온에서 3 u20124 분 동안 세포 배양 용기를 휴식 하 고, 세포를 분리 하는 데 도움이 되도록 용기의 바닥이 나 측면을 부드럽게 두드립니다. 세포의 대부분이 분리 되 면 반응을 멈추게 하기 위해 트립 신-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 4 mL 당 태아 소 혈 청 (FBS) 1 mL를 첨가 한다. 15 mL 원추형 튜브로 피 펫 팅 하 여 세포를 수집 하십시오. 인산 완충 식 염 수 (PBS)로 플라스 크를 헹 구 고 동일한 수집 튜브에 린스를 추가 합니다. PBS로 튜브를 15 mL로 채웁니다. 작은 취를 꺼내 세포를 카운트. 표준 조직 배양 원심 분리기에서 250 x g 에서 10 분 동안 스핀 다운 하 여 종양 세포를 수집 한다. 1×106 세포/m l의 밀도에서 PBS에서의 소생 된 yumm 1.7 세포. 100 μ l의 PBS에 1 x 105yumm 1.7 종양 세포를 피하에 주사 하 여 수용자의 오른쪽 측면에 4 내지 6 주 형의 남성 C57BL/6j 마우스, 기관 지침에 따라 마 취 된 (예를 들어, 3의 u20125% 아이 소 플 루 레인 흡입 가스, 마 취 뒷 발 핀치 반사의 부족에 의해 확인). 캘 리 퍼를 사용 하 여 수직 종양 직경과 높이의 격주 측정을 통해 종양 부피를 모니터링 합니다. YUMM 1.7 (종양 길이 x 폭 x 높이)/2를 계산 합니다. 종양이 막 만져 질 때 트랜스 임피던스 요법을 시작; YUMM 1.7 종양을 위해, 이것은 일반적으로 7 일 u201210 포스트 종양 이식입니다. 2. 말 초 혈액 단 핵 세포의 수집 뺨 블리드를 통해 각 종양-베어링 마우스에서 혈액의 100 u2012150 μ l를 수집 하십시오. 혈액이 채취 되는 동안, 각각의 마우스 처리 군에서 풀 피 (5 개의 실험 마우스 + 5 제어 마우스)를 포함 하는 단일 15 mL 튜브에서 헤 파 린을 5000. 혈액이 수집 된 100 μ l 당 10%의 헤 파 린 10 μ l를 사용 하십시오.참고: 혈액 응고를 방지 하기 위해 수집 하는 동안 자주 튜브를 섞는다. 제어 종양 담지 마우스는 실험 마우스와 동시에 블 레드 될 수 있지만, 치료 기와 동등한 조건을 보장 하기 위해, “대조” 혈액은 폐기 되거나, 치료 군의 혈액과 결합 하 여 추가로 제공 될 수 있다 치료 그룹에 대 한 실험 PBMC, 조사 관의 재량. 림프 구 분리 매체 4Ml( 재료 표참조) 1 15 ml 튜브를 5 u201210 마우스 블 레드에 설치 합니다. 천천히 층 혈액 (종양 베어링 마우스에서 수집) 매체의 상단에. 세포를 1000 u20121, 500xg에서 20 분 동안 회전 시켜 적혈구 로부터 PBMC를 분리 합니다. 원심 분리의 끝에서, 상부 혈장 층을 수집 하 고, 상기 버 코트 위에 잔존 하는 ~ 0.5 mL를 남기고, 추후 사용을 위해 4 °C에서 저장 한다 (단계 7.1). 버 리 코팅 층을 깨끗 한 15 mL 튜브에 넣고, PBS로 15 mL를 채우고, 표준 조직 배양 원심 분리기에서 250 x g 에서 10 분간 스핀을 수집 하 여 PBMC를 채취 한다. 상 청 액을 조심 스럽게 피 하 고 튜브를 쓸 었을 때 펠 릿을 소생 시킵니다. 펠 릿이 부드럽고 손실 될 수 있으므로 decant 하지 마십시오. 2 mL의 ACK 적혈구 용 해 완충 액 ( 재료 표참조)을 튜브에 추가 하 여 PBMC에서 남은 적혈구를 제거 합니다. 10 분간 얼음을 배양 합니다. PBS로 튜브를 15 mL로 채우고, 표준 조직 배양 원심 분리기에서 250 x g 에서 10 분 동안 아래로 돌려 PBMC를 수집 한다. 상 청 액을 조심 스럽게 벗으 며, 펠 렛을 쓸 면 서 소생 시킵니다. 펠 릿이 부드럽고 손실 될 수 있으므로 decant 하지 마십시오.참고: 이 단계에서, 정제 된 PBMC는 실험에 가장 적합 한 것으로 서 변형 될 수 있다. 다양 한 PBMC 성분 (혈소판, 단 핵 구, 다른 면역 세포 유형)은 필요에 따라 PBMC에서 고갈 되거나 분리 될 수 있다. 또한, PBMC 자체는 섹션 4 (제 2 항 또는 전 항 후의 판 통과 전 또는 후)의 프로토콜 단계에 따라 3.3\u 20123.8 및 YUMM 1.7 세포에 대 한 PBMC를 대체 하 여 8-MOPA에 노출 될 수 있다. 이것은 치료의 면역 원 성 능력을 자르고, 대신에 면역성이 있는 포용 력을 승진 시킬 것입니다. 각각의 처리 군 (5 개의 실험 마우스 + 5 대조 군 마우스)에 대해, FBS의 PBMC 펠 렛을 300 μ l로 소생 시켰다. 3.8-암 세포의 걸 레/UVA 치료 배양 하 고 1.2 ~ 1.3 단계에서 기재한 바와 같이 YUMM 1.7 종양 세포를 수집 하 여8-걸 레-노출 된 종양 세포 항 원 공급원을 제조 하였다. 5 마리의 마우스의 처리 군 당 2.5 x6 yumm 1.7 종양 세포를 준비 한다. 각 처리 군의 경우, 종양 세포 펠 렛을 FBS에서 2.5 세포/300 μ l (~ 8.33 x 106 세포/m l )에서 소생 한다. 조직 배양 후드가 꺼진 경우, 8 개 걸 레 ( 재료 표참조)를 추가 하 여 최종 8 개 걸 레 농도 100 Ng/ML의 yumm 1.7 종양 세포 현 탁 액을 첨가 합니다.주의: 8-MOP는 광 활성화 가능한 DNA 손상 제 및 발암 물질입니다. 취급 및 분주 시 주의 하 여 노출 된 피부와의 접촉을 피하고 적절 하 게 폐기 하십시오. 셀을 잘 섞은 후, 셀 용기를 주석 호 일에 싸서 37 °C에서 20 분 동안 배양 하십시오. FBS 1 mL의 5 마리 (2.5 x 106 yumm 1.7 종양 세포)의 모든 처리 그룹에 대해 1 개의 웰을 충 진 하 여 12 웰 조직 배양 판을 예비 코팅 하 고, 4 °C에서 20 분 동안 충전 된 플레이트를 냉장 보관 한다. UVA 광원을 켜서 미리 따뜻하게 합니다.주의: UVA 빛은 발암 물질입니다. UVA 광원으로 작업 하는 경우 신속 하 고 신중 하 게 작동, 노출 로부터 피부를 보호 하 고 얼굴과 눈을 보호 하기 위해 얼굴 방패 나 고글을 사용 합니다. 20 분 후, 냉장 된 12 웰 플레이트 (단계 3.5)를 조직 배양 후드에 옮기고, 웰에서 FBS를 제거 하 고, 300 µ L (2.5 x106 세포/웰)을 추가 하 여 대 걸 레 노출 된 종양 세포 (단계에서 3.4)를 웰 당 한다. 4j/cm2의 총 조사를 위해 미리 데워 진 UVA 광원에 세포 함유 판을 노출 시킨다.참고: 여기에 기재 된 8-걸 레 농도 및 UVA 용량은 유 MM 1.7 종양 세포 라인에 대해 교정 된다. 노출 1 주일 이내에 100%의 종양 세포 사 멸을 일으키기에 충분 한 8-걸 레/UVA 용량의 적정은 효과적인 사 멸 용량을 결정 하기 위해 각 실험 종양 세포 주에 대해 수행 되어야 합니다. 이것은 세포가 레트로-오비 탈 (단계 6.1) 및 따라서 어떤 손상 되지 않은 종양 세포가 처리 된 동물에서 눈 종양을 형성할 수 있기 때문에 마우스를 생체 내 TI 실험에 결정적으로 중요 합니다. 지침으로 서, u20128, 100 \\ u2012200 ng/mL 8-걸 레의 4 \\의 J/cm2 는 대부분의 종양 세포 주에 대 한 일반적인 유효 범위입니다. 각각의 웰에서 8-걸 레 처리된종양 세포를 수집 하 고, 플레이트와 파이 펫 팅을 조심 스럽게 하 여 완전 한 세포 회복을 보장 합니다. 4. 셀의 TI 플레이트 통로 5 마리의 마우스의 각 처리 그룹에 대해, 적절 한 2.11 PBMC의 1 1.5 mL의 원뿔형 튜브 300 μ l와 8-걸 레-처리 된 종양 세포의 300 μ l를 결합 한다 (단계 3.9에서). 세포를 섞는다. 10 mL 주사기를 사용 하 여 TI 튜빙의 ‘ 입구 ‘와 ‘ 출구 ‘ 세트를 채웁니다.재질 표) FBS. 튜브를 채우기 위해 튜브 클램프를 열고 튜브가 주사기를 분리 하기 전에 충전 되 면 클램프를 닫고 튜빙 내부에 FBS을 유지 합니다. P1000 피 펫을 사용 하 여 (단계 4.1에서) TI 플레이트에 PBMC 및 종양 세포 믹스를 추가 합니다 ( 재료 표참조). 플레이트를 45° 각도로 잡고 파이 펫 팁을 TI 플레이트 흡입구에 단단히 넣고 플레이트를 천천히 채워 거품을 피하십시오. 피 펫 플런저를 방출 하기 전에 흡 기에서 피 펫 팁을 제거 하십시오. 플레이트는 450 μ l를 보유; 나머지 셀을 1.5 mL 원뿔형 튜브에 반환 합니다. FBS 채워진 튜브, 세포 채워진 TI 플레이트 및 37 °C의 조직 배양 인큐베이터의 나머지 세포를 1 시간 동안 포함 하는 1.5 mL 원뿔형 튜브를 배양 한다. 배양 후, 중력에 의해 TI 튜브를 비우고 클램프를 해제 합니다. P1000 파이 펫을 사용 하 여 플런저를 플레이트 포트로 함몰 시킨 후 파이 펫 팁을 삽입 하 여 TI 플레이트에서 셀을 제거 합니다. 플레이트를 45° 각도로 잡고 P1000 파이 펫 팁을 채웁니다. 원래의 1.5 mL 원추형 튜브에 다시 셀을 놓습니다. TI 플레이트를 실행 하려면 출구 튜브를 플레이트에 연결 하 고 TI 플레이트를 실행 중인 시스템에 고정 하십시오. 1 mL 주사기를 사용 하 여 1.5 mL 코니 컬 튜브에서 PBMC 및 종양 세포 혼합의 600 μ l를 끌어 내 고 주사기에 있는 기포를 제거 하 고 클램프가 있는 입구 튜브에 주사기를 부착 하 고 유체가 튜브의 끝에 도달 할 때까지 천천히 채우십시오. 입구 튜브의 자유 끝을 TI 플레이트에 부착 하 고 나머지 볼륨을 부드럽게 로드 합니다. 입구 클램프를 닫으십시오. 1 mL 주사기를 분리 하 고 주사기 펌프에 입구 튜브를 연결 합니다. 셀 수집을 위한 깨끗 한 1.5 mL 원추형 튜브에 출구 튜브를 고정 합니다. 주사기 펌프 유량을 0.09 mL/min으로 조정 하지만 아직 펌프를 시작 하지 마십시오. Ti 플레이트를 실행 하는 플랫폼 또는 다른 수단 (예: 판의 한쪽 끝 아래에 있는 작은 평평한 물체)을 사용 하 여 주사기 펌프 쪽으로 TI 플레이트 ~ 30° 를 기울입니다. 조심 스럽게 입구 튜브에 클램프를 놓습니다. 주사기 펌프를 시작 하 고, TI 플레이트가 채우는 방법을 주의 깊게 관찰 하 고, 필요에 따라 비디오 튜빙 또는 플레이트를 통해 공기 방울이 흐름을 방해 해야 합니다. TI 플레이트가 완전히 채워진 후에는 비워도 반대 방향으로 30° 까지 기울입니다. 모든 세포와 액체가 1.5 mL 원추형 수집 튜브에 있으면 펌프를 중지 하십시오. TI 플레이트를 세척 하려면 주사기 펌프에서 입구 튜브를 분리 하 고 600 μ l FBS 채워진 1 mL 주사기에 연결한 다음 4.8 \ u 20124.9 단계를 수행 하십시오. 시린 지 펌프 유량을 0.49 mL/min으로 조정 하 고, 입구 클램프를 풀어, 4.12 \ u 20124.13 단계에서 설명한 바와 같이 TI 플레이트를 실행 하 고 동일한 1.5 mL 원추형 튜브에서 세척을 수집 한다. 모든 부착 세포를 분리 및 용 출 하는 데 도움이 되도록 전체 시간에 티 판을 가볍게 터치 하거나 탭 하십시오. 1.5에서 수집 된 원추형 튜브를 250 x g 의 벤치탑 마이크로 퓨 게에서 8 분간 회전 시켜 상층 액을 버립니다. 5. 밤새 배양 배지 용 자가 마우스 세럼의 제조 항 응고 제 없이 10 u201212 주 오래 된 C57BL/6J 마우스에서 혈액을 수집 합니다 (예: 눈 출혈, 꼬리 정 맥 출혈, 뺨 출혈 또는 심장 천자에의 한 말단 출혈). 필요한 혈 청의 300 μ l 마다 1 mL 혈액 수집을 추정 합니다.참고: 하나는 실험에서 5 마리의 생쥐의 모든 처리 군에 대해 300 μ l의 혈 청을 필요로 할 것 이다. 혈액이 4°c에서 밤새 응고 되도록 하십시오. 응고 된 혈액을 3000 x g 에서 15 분간 아래로 돌려 조심 스럽게 최고 혈 청 함유 층을 모으십시오.참고: 혈 청은 밤새 세포 배양 배지를 만들기 위해 즉시 사용 될 수 있다 (단계 6.1), 또는 미래 실험을 위해 보존. 혈 청을 보존 하기 위해-20°c에서 알 수 없는 곳에 고정 하십시오. 6. 항 원과 함께 PBMC의 하룻밤 공동 배양 상기 PBMC 및 종양 세포 펠 렛 (단계 4.5)을 2 mL의 클리어 RPMI로 15% 자가 마우스 혈 청 (단계 5에서 제조)으로 소생 시켰다. 35 mm의 비 조직 배양을 통해 멸 균 된 접시를 처리 하 고, 표준 조직 배양 조건 하에서 밤새 배양 하였다 (37, 5% co2).참고: PBMC가 비 세포 항 원 (펩타이드, 나노 입자, 단백질 등)과 함께 사용 되는 경우, 프로토콜의 섹션 3을 생략 하 고 섹션 2에서 직접 섹션 4로 진행 하 여, 원하는 항 원을 TI 플레이트에 추가 하 고 밤새 공동 배양 하는 PBMC를 여기에 전달 6.1 단계. 다음날, 접시의 바닥에서 모든 부착 세포를 신중 하 게 분리 하 고 조직 배양 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시를 회전 시키면서도 세포 수집을 보장 합니다. 15 mL 튜브에 세포를 수집 합니다. 접시에 2 mL PBS를 추가 하 고 같은 튜브에 세포를 수집, 스크 래핑 단계를 반복 합니다. 1ml PBS로 35 mm 접시를 헹 구 고 동일한 튜브에 린스를 추가 하십시오. 표준 조직 배양 원심 분리기에서 250 x g 에서 10 분간 스핀 하 여 세포를 수집 한다. 상 청 액을 조심 스럽게 피 하 고 튜브를 쓸으 킴으로써 펠 렛을 소생 시킵니다. 펠 릿이 부드럽고 손실 될 수 있으므로 decant 하지 마십시오. 7. 종양 베어링 마우스에 TI 처리 된 세포의 재 주입 2.4 단계에서 제조 된 자가 혈장을 스핀 다운 750에서 15 분간 침 지 하 여 임의의 미 립 자. 세포 펠 렛 (6.4 단계에서)을 자가 혈장 또는 PBS의 600 μ l에서 소생 시켰다. 마우스 당 100 μ l의 세포를 적절 하 게 마 취 시킨 레트로 궤도 신경 총에 주사 하십시오 (예: 3 \ u20125% 아이 소 루 란은 가스, 마 취는 뒷 발 핀치 반사의 부족으로 확인) 종양 베어링 실험 마우스. 원한다 면, 대조 군 종양 베어링 마우스를 자가 혈장의 100 μ l 단독 또는 PBS로 재 주입 한다. YUMM 1.7 종양 방위 쥐를 위해, 총 6 개의 치료를 위해 3 주 동안 2 ~ 7.2의 치료를 일주일에 두 번씩 반복 하십시오. 매주 월요일과 목요일에 종양 담지 마우스의 PBMC (프로토콜 섹션 2 \ u20124)를 수집 하 여 처리 하 고, 화요일 및 금요일에 하룻밤 인큐베이션 (프로토콜 섹션 5/u20127) 후에 다시 주입 합니다.참고: 이러한 치료 요법은 마우스에서의 YUMM 1.7 종양의 특정 성장 동역학을 위해 개발 되었다. 그것은 다른 종양 시스템에 대 한 적정 해야 할 수 있습니다 느린 또는 빠른 종양 성장 속도-각각 증가 또는 치료의 수를 감소. 캘 리 퍼를 사용 하 여 수직 종양 직경과 높이의 치료 행정 (화요일과 금요일) 시에 격주 측정을 통해 종양 부피를 모니터링 하십시오. 제어 종양 볼륨이 기관 지침 및 프로토콜에서 허용 하는 최대 크기에 도달 하면 실험을 종료 합니다. 8. 인간의 혈액의 Ssmall 볼륨 치료에 대 한 프로토콜 적응 인간의 혈액에서 첫 번째 격리 PBMC에 의해 인간 세포와 사용 하기 위한 프로토콜을 적응. 항 응고 제로 서 헤 파 린을 선호 하는 PBMC 격리 프로토콜과 함께 사용 하십시오. 격리 된 PBMC 분 획이 최상의 프로토콜 결과를 위해 생리 적으로 혈소판 수를 포함 하 고 있는지 확인 하십시오. 모니터 혈소판은 모든 표준 혈액학 카운터를 사용 하 여 사전 및 후 PBMC 분리를 카운트. 인간 세포 항 원 공급원을 사용 하는 경우, YUMM 1.7 세포에 대 한 제 3 항에 기재 된 단계에 따라 인간 항 원을 치료 한다. 적정 8-MOP 및 UVA 복용량을 따라. TI 플레이트 당 최대 3 x 10 PBMC를 사용 하 여 섹션 4에 설명 된 플레이트 통로 단계를 수행 합니다. 배양 PBMC에서 밤새 세포/기타 항 원을 선택 하 고, 제 6 항에 기재 된 바와 같이, 6.1 단계에서 밤새 배양 하는 마우스 플라즈마를 자가 조직 하는 15% 인간 AB 혈 청을 대체 한다. 원하는 분석 결과 세포를 사용 합니다. 예를 들어, 항 원-반응성 T 세포와의 공동 배양은 TI 처리 된 세포에 의해 개시 된 항 원 특이 적 T 세포 반응을 관찰 한다.

Representative Results

우리는 최근에 마우스 대 사람 확장 가능한 소형 ECP 장치, TI 플레이트 (도 1a)를 개발 하 고 대응 하는 처리 프로토콜을 설계 하였다. 장치 및 프로토콜은 주요 셀룰러 및 생체 내 기능에 대 한 면역 ECP를 재생산 하 여 “트랜스 임피던스 화” 라고 불립니다. 뮤 린 트랜스 임피던스 프로토콜11 (도 1b)은 사 멸 8-대 걸 레-노출 된 종양 담지 쥐 로부터의 말 초 혈액 단 핵 세포 (PBMC)의 체 외 TI 플레이트 통로로 구성 되어 종양 세포. 특히 TI 챔버는 표준 현미경 슬라이드 형식에 맞게 투명 하 고 크기가 조정 되므로 프로토콜의 어느 지점에서 나 TI 플레이트 내에서의 셀 상호 작용을 쉽게 시각화할 수 있습니다 (비디오 1). TI-플레이트-활성화 된 면역 세포는 8-걸 레 노출 사 멸 종양세포와 함께 밤새 인큐베이션 되어, 종양 세포 흡수, 처리 및 DCs로의 종양 항 원의 전달을 촉진 한다. 다음날, 상기 공동 배양 된 세포 혼합물은 종양-담지 동물의 혈 류로 복귀 된다. 대조 동물은 동일한 혈액 채취 절차를 거치고, 종양 성장에 대 한 림프의 영향을 정상화 하기 위해, 대신 PBS 재 주입을 받는다. 모든 동물의 종양 성장은 실험 전반에 걸쳐 모니터링 된다. YUMM 1.7 신 유전학 뮤 린 흑색 종 모델 (18)을 사용한 연구에서, 트랜스 임피던스 화 프로토콜은 각 동물의 총 6 개의 치료법에 대해 3 주에 걸쳐 매주 2 회 반복 되었다 (도 1b). 치료 된 모든 동물 (> 100)에서 잘 용인 되 고, 2 년에 걸쳐 실시 된 9 개의 독립 실험에서 관찰 된 것과 같이 치료 대 대조 군 동물에서의 YUMM 1.7 종양 성장의 감소를 지속적으로 나타내 었 다 (도 2a, B). 상기 결과는 종양 성장 데이터의 누적을 표시 하 고, 한 실험에서 수행 된 모든 실험을 통해 동물에 대 한 치료 및 대조 군 (도 2a) 뿐만 아니라 개별 동물에 대 한 대표적인 종양 성장 곡선을 제공 하는 것을 의미 (그림 2b). 우리는 프로토콜의 성공은 결정적으로 처리 된 PBMC에서 단 핵 세포의 존재, PBMC 분 획에서 혈소판의 존재, 및 TI 플레이트 통로 단계에 달려 있다는 것을 발견 했습니다. 판 통로가 생략 되 면, 또는 혈소판 또는 단 핵 세포가 PBMC 분 획에서 고갈 될 때, 치료 효과가 더 이상 관찰 되지 않는다 (도 3a). 치료는 또한 사 멸 종양 세포의 존재를 요구 한다. 면역 세포 또는 항 원 공급원 또는 불일치 항 원의 존재 하에서, 예를 들어 YUMM 1.7 종양을 베어링 하는 생쥐가 MC38 결 장 암 세포를 사용 하 여 치료 되는 경우에는 효과가 없다 (도 3b). 면역 화 결과를 위해 8-MOP에 PBMC 노출을 피하는 것도 중요 합니다. 8-MOPa-노출 된 PBMC는 항 종양 면역성을 심문 하거나 심지어 역전 시킬 수 있을 뿐만 아니라, 실험에서와 같이 비 노 광 된 세포의 면역 화 가능성을 저해 하는 것은 8-걸 레아노출 및 8-걸 레 산 A-보호 된 PBMC는 관찰 가능한 항 종양 효과와 함께 사용 되었다 (도 3c). 인간 PBMC로, TI 챔버 및 트랜스 임피던스 화 프로토콜은 임상 ECP 플레이트 (표 1)에 의해 달성 된 것 으로부터 세포 표면 및 세포내 활성화 마커로 구별할 수 없는 성공적인 단 핵 활성화를 DC로 이끌어 냅니다. 마우스 연구에서와 같이, dc 활성화 (도 4a)는 처리 및 제시 된 항 원에 대 한 트랜스 임피던스 화-생성 된 DCs의 능력 (도 4b,C)은 PBMC에서의 혈소판의 존재 및 TI 플레이트에 결정적으로 의존 한다. 트랜스 임피던스 활성화 된 인간 DCs는 전체 8-걸 레-노출된인간 종양 세포에서 펩 티 드 항 원 (도 4b) 또는 항 원을 효과적으로 처리 및 교차 하 여 시험관 내에서 인간 항 원 특이 적 T 세포 주를 활성화 시킬 수 있다 분석 법 (도 4c)은 TI 및 혈소판 의존적 방식 이다 (도 4b, C). 그림 1: TI (트랜스 임피던스) 챔버 및 프로토콜 회로도 (A) 트랜스 임피던스 처리 챔버 (TI 플레이트)의 다이어그램과 사양. (B) 트랜스 임피던스 화 처리 실험 워크플로우의 개략 설명. 간략하게, 동물은 신 제네 믹 종양 세포와 함께 피하 (s.c.)를 접종 하 고; 명백한 종양을 가진 동물은 8-걸 레/UVA 처리 된 종양 세포의 존재 하에서, 자가 혈소판 코팅 된 TI 판을 통과 하는 혈액, pbmc에서의 PBMC의 분리, pbmc 및 종양 세포 공동 인큐베이션에 의해 매주 2 회 치료 되며, 동일한 종양 베어링 동물에 정 맥 내 세포의 재 주입. 종양 부피는 실험 전반에 걸쳐 측정 된다. 이 그림은11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: 트랜스 임피던스는 YUMM 1.7 흑색 종 종양의 성장을 통제 합니다. (A) 시간 경과에 따른 유 mm 1.7 종양 부피는 1 x 10의 yumm 1.7 종양 세포를 접종 하 고 6 개의 트랜스 임피던스 화 처리 (블랙 라인) 또는 6 개의 대조 치료 (그레이 라인)를 수용 하는 C57BL 마우스에 대해 플로팅 하였다. 데이터는 2 년에 걸쳐 9 개의 독립적인 실험을 통해 누적 됩니다. (B) 개별 마우스에 대 한 종양 성장을 표시 하는 각 라인과 함께 단일 대표 yumm 1.7 트랜스 시몬 즈 톤 실험에서 데이터. (A 와 B) 모든 실험에서 “PBS 제어” 마우스는 실험 동물 들과 동일한 일정으로 블 레드 하였으며, 6 개의 멸 균 PBS 재 주입을 받았다. 오차 막대는 Sidak의 다중 비교 테스트를 사용 하 여 각 시간 포인트에 대해 계산 되는 SEM, p 값을 나타냅니다. p = 0.0013; , p < 0.0001. 이 그림은11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: 트랜스 임피던스는 단 핵 세포 및 혈소판을 필요로 하는 TI 플레이트-통과된 pbmc 분 획 뿐만 아니라 8 -항 원-일치 하는 종양 세포내의 치료와 8-걸 레의 보존성을 살려주는 것 이다. (A) 유 mm 1.7 종양 부피는 1 * 10의 yumm 1.7 종양 세포를 접종 하 고 6 개의 트랜스 임피던스 화 처리 (고체 검정 선), 6 개의 대조 치료 (고체 회색 선) 또는 6 개의 TI 치료를 받은 C57BL에 대해 플로팅 단 핵 구 또는 혈소판이 플레이트 통과 단계 이전에 PBMC 로부터 고갈 된 곳 (각각 CD11b 및 CD41 공 핍 키트를 사용 하 여) 또는 플레이트 통로는 생략 하였다 (점선). (B) 시간 경과에 따른 종양 부피는 1 x 10의 yumm 1.7 종양 세포를 접종 하 고 6 개의 트랜스 임피던스 화 처리 (고체 흑색 선)를 수신 하 고, 6 개의 대조 군 치료 (C57BL), PBMC 단독 (파선) 처리된yumm 1.7 세포를 단독으로, 또는 TI를 이용 하 여 8-Mop 처리된MC38 종양 세포 (점선)를 사용 한다. (C) 시간 경과에 따른 종양 부피는 C57BL5 yumm 1.7 종양 세포를 접종 하 고 6 개의 트랜스 임피던스 화 처리 (고체 흑색 선), 6 개의 조절 처리 (고체 회색 선)를 수신 하 고, 6 개의 TI 처리 PBMC는 플레이트 통로 직전에 8-걸 레 에이트에 균일 하 게 노출 하였으며, 플레이트 통로 직후에 8-걸 레 시에 PBMC가 균일 하 게 노출 된 6 개의 티 트리트먼트, 또는 플레이트 통로 후의 ti 세포가 혼합 된 6 개의 치료법을 1:1 8-걸 레에 균일 하 게 노출 된 PBMC의 동일한 수 의 조사 (점선). (A, B 및 C) 모든 실험에서 “PBS 제어” 마우스는 실험 동물 들과 동일한 일정으로 블 레드 하였으며, 6 개의 멸 균 PBS 재 주입을 받았다. 대표적인 실험을 위해 데이터가 제공 됩니다. 바는 Sidak의 다중 비교 테스트를 사용 하 여 각 시점에 대해 계산 된 P-값을 SEM으로 나타내고; *, p < 0.05; p < 0.01; , p < 0.001; , p < 0.0001; NS = 차이점이 중요 하지 않습니다. 이 그림은11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: TI 챔버가 있는 TI 프로토콜은 플레이트 통로 및 혈소판에 따라 DC 성숙, 고유한 활성화 프로 파일 및 인간 PBMC에서의 T 세포 활성화 용량을 빠르게 유도 합니다.FACS는 갓 분리 한 인간 PBMC 중에서 지시 된 마커 (‘ 제어 ‘), ti 프로토콜을 이용 하 여 처리 한 pbmc (‘ ti ‘) 또는 플레이트 통로를 생략 한 ti 처리 된 pbmc 중에서 표시 된 표지를 분석 하 여 혈소판을 고갈 시켰다 CD41 비드 키트를 플레이트 통로 이전에, 또는 둘 다 수행 하였다. 데이터는 세 명의 혈액 기증자와 6 개의 독립적인 실험을 요약 합니다. 막대는 평균값을 나타내고, 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 쌍 t 검정을 사용 하 여 계산 된 각 비교에 대 한 P-값; *, p < 0.05; p < 0.01. 패널이11에서 수정 되었습니다. B.혈소판 함유 또는 혈소판 고갈 된 TI-처리 된 인간 PBMC는 무관 한 (SI감염 kl) 펩 티 드와 함께 하룻밤 동안 또는 긴 펩타이드와 함께 머리 및 목 편평 상피 세포 암에 관련 된 HPV E7 단백질을 공동 배양 하였다. 상기 PBMC는 CD8 펩타이드에 특이 적으로 반응성 인 인간 T 세포 라인을 자극 하 여 사용 하였다. T 세포 자극은 5 일 배양 후 IFNg 생산을 통해 측정 하였다. (C) 혈소판 함유 또는 혈소판 고갈 된 TI-처리 된 인간 PBMC는8-걸 레 처리 된 머리 및 목 편평 상피 세포 암 세포 주 SCC61를 사용 하 여 밤새 배양 하였다 (SCC61 hpv E6/7) 또는 발현 하지 않음 (SCC61 ) 항 원 성 HPV E6 및 E7 단백질19. 상기 PBMC는 CD8 펩타이드에 특이 적으로 반응성 인 인간 T 세포 라인을 자극 하 여 사용 하였다. T 세포 자극은 5 일 배양 후 IFNg 생산을 통해 측정 하였다. (B 와 C) 데이터는 각각의 3 개의 반복을 갖는 대표적인 실험을 보여준다. 막대는 평균값을 나타내며 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. Sidak의 다중 비교 테스트를 사용 하 여 계산 된 각 비교에 대 한 P-값; , p < 0.001; , p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 마커 매개 변수 치료 TI 프로토콜을 사용 하는 ECP 플레이트 Ti 프로토콜이 장착 된 TI 플레이트 p 값 ECP vs TI 클 라스 박사 Δ MFI 100.1 ± 42.4 439.8 ± 152.5 417.7 ± 152.2 Ns CD80 Δ 3.9 ± 1.1 22.3 ± 7.2 24.5 ± 7.2 Ns CD83 Δ MFI 0.3 ± 0.2 53.3 ± 9.7 51.4 ± 17.4 Ns CD86 Δ MFI 10.8 ± 1.7 103.9 ± 23.4 87.1 ± 17.6 Ns PLAUR Δ MFI 54.5 ± 12 721.4 ± 183.6 528.7 ± 135.5 Ns ICAM1 Δ MFI 12.2 ± 1.6 179.6 ± 28.5 192.5 ± 25.4 Ns ITGB5 Δ MFI 53.6 ± 25.7 97.1 ± 31.6 103.8 ± 32.8 Ns CCL2) Δ 0.6 ± 0.5 70.1 ± 6.7 55.2 ± 8.9 Ns CXCL5 Δ 0.7 ± 0.4 39.1 ± 7.2 41.5 ± 4.7 Ns CXCL16 Δ 0.3 ± 0.2 28.0 ± 8.8 35.3 ± 11.7 Ns CD105 (내 글 린) Δ MFI 3.6 ± 0.3 124.3 ± 25.4 141.8 ± 33.2 Ns CD112 (2) Δ MFI 10.9 ± 1.8 47.3 ± 5.2 50.9 ± 9.2 Ns CD120a) Δ MFI 10.1 ± 2.6 2.2 ± 1.4 1.8 ± 1.1 Ns CD137L (4-1BBL) Δ MFI 2.9 ± 1.5 1.0 ± 0.4 1.2 ± 0.6 Ns 표 1: ti 챔버가 있는 ti 프로토콜은 임상 ECP 챔버와 ti 프로토콜에 의해 유도 된 것과 동등한 DC 성숙을 신속 하 게 유도 합니다. FACS의 살아있는 인간 CD11c + 세포에서의 상응 하는 IgG 제어 로부터 지시 된 마커 들의 변화를 분석 하 고, TI 프로토콜에 따라 임상 ECP 플레이트를 통과 한 PBMC (“처리 되지 않은” TI 프로토콜을 가진) 및 밤새 배양 하거나 TI 프로토콜 (“TI 플레이트와 프로토콜”)로 처리 한 PBMC를 분석 하 여 밤새 배양 후 분석 하였다. 전체 세포 인구가 변경 된 클 라 박사와 같은 마커의 경우 데이터는 평균 형광 강도의 변화로 표현 됩니다 (MFI). 셀의 하위 집합만 마커를 표현 하는 마커의 경우, 예를 들어 CCL2와 같이, 살아있는 CD11c + PBMC의 퍼센트 마커-양성 세포의 차이는 대신 표현 된다. 데이터는 세 명의 혈액 기증자와 6 개의 독립적인 실험을 요약 합니다. 각 마커에 대 한 데이터는 평균 (SEM)의에이 지 ± 표준 오차로 표현 된다. 쌍 t 검정을 사용 하 여 계산 된 각 비교에 대 한 P-값; NS = 차이점이 중요 하지 않습니다. 표가11에서 수정 되었습니다. 비디오 1: TI 플레이트 내에서 혈소판 및 면역 세포 상호작용의 살아있는 세포 이미징.상기 프로토콜 섹션 2에 기재 된 바와 같이 제조 된 PBMC를 상기 단계 4.2.3에서 정적 인큐베이션 기간을 제외 하 고는 제 4 항에서 설명한 바와 같이 트랜스 임피던스 화 판에 노출 시켜 1 시간에서 30 분으로 감소 시켰다. TI 프로토콜 동안, 표준 현미경 슬라이드와 동일한 크기의 TI 플레이트는 형광 이미징 시스템의 슬라이드 홀딩 스테이지에 장착 되었고, 그 안에 있는 셀은 플레이트 충전 시 40x 배율로 이미지를 촬영 하 고 37 ° c에서 이미징 하였다 (4.2.2 ), 플레이트 인큐베이션 (4.3.5) 단계 및 플레이트 흐름 연속 이미지를 획득 하 고 “자동 스캔 루틴” 소프트웨어를 사용 하 여 동영상을 제작 했습니다. 비디오 아래의 캡션은 셀이 촬영 되 고 있는 프로토콜의 단계를 나타냅니다. 비디오의 화살표와 원으로, 관련 캡션이 있는 셀과 관심 영역을 가리킵니다. 10 μ m 스케일 바는 비디오 전체의 우측 하단에 존재 한다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 다운로드 합니다.)

Discussion

위에서 설명한 소형화 된 장치와 프로토콜은 마우스 실험 시스템에서 ECP의 메커니즘에 대 한 효율적인 실험실 조사 및 작은 인간 혈액 샘플을 허용 한다. 이것은 큰 진보입니다. 예를 들어, 마우스 모델 ( 11)에서 고 형 종양에 대 한 트랜스 임피던스 화의 효능을 처음으로 입증 하 여, 인간 종양학에서 유사한 적용의 미래 가능성을 개방 하는 것이 허용 되었다.

여기에 설명 된 트랜스 임피던스 화 장치 및 방법을 개발 하기 전에 ECP의 모든 측면을 완전히 조사 하는 것은 불가능 했습니다. 마우스 모델에서, 8-걸 레 치료 의 양태는 페 트리 디쉬12,20에서 세포를 처리 하 여 다소 복제 될 수 있었지만, 상기 방법으로 플레이트 통로 내로 통합 하는 능력은 없었다. ECP의 생리 적 DC 활성화14에 매우 중요 한 동적 혈소판 상호 작용을 제공 합니다. 인간 연구에서, 대안적으로, 유동 성분은 완전히 존재 하였으나 특정 세포 성분을 선택적으로 노출 시키는 능력을 8-MOPA에, 또는 그것 으로부터 보호 하기 위해21,22를 누락 하였다. 이는 ECP 메커니즘에 대 한 완전 한 이해와 내성 또는 내성에 대 한 최적화를 방지 합니다. 또한, 임상적으로 작동 하는 데 필요한 혈액의 양은 ECP 장치는 크고, 방해 과학적 탐구 이다. 처음으로 여기에 설명 된 소형 ECP 장치 및 프로토콜은 효율적이 고 완전히 유연 하며 조정 가능한 실험실 ECP 모델링을 가능 하 게 합니다. 또한 TI 플레이트는 현미경 검사를 통해 플레이트 내에서의 세포 상호 작용을 실시간으로 시각화 하 고 모니터링 합니다.

생체 내 및 생체 내 시스템을 모두 사용 하는 프로토콜의 성공의 경우, 처리 된 PBMC에 기능적 DCs로 활성화 될 수 있는 단 핵 구를 포함 하는 것이 중요 합니다. 이러한 활성화를 진행 하기 위해서는, PBMC 분 획이 건강 하 고, 활성화 가능한 혈소판의 생리 적 수를 포함 하 고, TI 플레이트 통로 프로토콜이 밀접 하 게 따르는 것을 보장 하는 것도 필요 하다. 새로 활성화 된 DCs를 특정 반응성으로 향하게 하기 위해, 이들은 항 원과 함께 제공 되어야 한다. 우리는 항 암 내성에 대 한 항 원 전달의 가장 효율적인 방법이 항 원과 함께 8-대 걸 레 노출 된 종양 세포를 포함 하는 새로 활성화된 DCs의 밤새 공동 인큐베이션 된다는 것을 발견 했습니다. 이것은 종양 항 원의 사전 지식을 필요로 하지 않고 면역 원 성 항 암 반응을 만들 수 있다는 추가 이점이 있다, DCs를 선택 하 여 허용 함으로써. 그러나, 항 원이 알려져 있는 경우에, 우리는 공동 인큐베이션에 있는 항 원으로 자유로운 펩 티 드를 사용 하는 경우에 ex vivo 시스템에 있는 몇몇 성공을 했습니다. 면역 원 성 응용 프로그램의 경우 DCs 자체를 8-MOP 노출 로부터 보호 해야 합니다. 마지막으로, 생체 내 실험에서, 항 종양 내성이 가능한 동물 모델과 함께 일 하는 것이 중요 하다. 트랜스 임피던스 화는 활성화 된 항 원 특이 적 DCs를 생성 하 여 인체에서 선천적인 면역 반응을 시작 하는 작용을 합니다. 치료 된 마우스에서 NK, CD4 또는 CD8 T 세포의 장애 활성 또는 결핍은 프로토콜의 효능5,11에 영향을 줄 것 이다.

여기에서 설명 하는 프로토콜은 마우스 고체 신 유전학 종양 모델에 최적화 된 증명 원칙 중 하나 이지만, 그럼에도 불구 하 고 많은 기회를 보여준다. 종양학의 ECP 메커니즘은 단지 해명 되 고 있으며 이해를 돕기 위해 여전히 많은 공간이 있습니다. 더욱 광범위 하 게, 생리 활성 마우스 및 인간 DCs를 생성 하 고,이를 항 원 특이 적 면역성으로 선택적으로 지시 하는 능력은 암을 넘어서는 많은 잠재적인 응용을 갖는다. 동일한 작업을 수행 하는 능력 대신 Dc 항 원 특정 허용 오차를 향해 직접, ECP 자체의 내성 효능에 의해 제안 된 대로, 또한 광범위 한 의료 의미. 이 방법으로, 우리는 도구를 제공 하 고 생리 DC 치료에 관심이 있는 사람에 대 한 연구의 생산적인 거리를 열 수 있도록 노력 하겠습니다.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 NIH 포자 그랜트 1 P50 CA121974 (알에 델 슨, 엠 지 아르디 아)에 의해 지지 되었다. NIH 암 센터 지원 교부 금 3 P30 CA16359-28S1 (r.에 델 슨 엠 지 아르디 아); 하 워드 휴 스 메디컬 인스티튜트 트레이닝 펠로 우 쉽 (a. 바실리); 그리고 뉴욕의 심장 재단 (알에 델 슨, a. 벤 투라,에이 바실리 스). 부분 지원은 R01 CA196660에서 m. 보 센 버그에 의해 제공 되었다.

저자는 로버트 티 겔로의 멘토링, 지도 및 실험적 통찰력에 감사 합니다. 우리는 우리의 동료에 게 감사 합니다 Fraunhofer IBMT, 특히 닥터 토 스텐 놀, ECP 동등한 TI 챔버를 개발 하 고 제공 하기 위한. 니콜라스 테오도시우스는 YUMM 실험의 초기 단계를 친절 하 게 도왔습니다. 저희는 자원 봉사자 혈액 기증자,에 거 크리스 텐 슨과 전문 인력에 게 감사의 도움을 제공 합니다. 웬 델 야 브로 박사와 나탈리 아 Issaeva 박사는 SCC61 및 SCC61/7 세포 주를 우리와 함께 친절 하 게 공유 했습니다. 프로젝트에 대 한 기술 지원은 줄리아 루이스 박사에 게 FACS 프로토콜 자문 및 e. Menet, g. 토 카 무 나, c. 코트에서 예일 FACS 코어에 대 한 감사를 드립니다. TI 플레이트 내의 세포의 영화 이미지는 펠릭스 리 베라-몰리 나 박사, 세포 생물학과 예일 시네마 이미징 센터, 예일대의의 도움으로 인수 되었다. 영화 제작은 앤드류 오스본, 수석 비디오 프로듀서, 예일 의학의 학교 통신 사무실에 의해 감독 되었다.

Materials

8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) Therakos, Inc Rx only, NDC No. 64067-0216-01 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
AB serum Lonza BioWhittaker 14-498E Protocol step 8.5 – overnight culture of human PBMC
ACK red cell lysis buffer Lonza BioWhittaker 10-548E Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging VetEquip 901820 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Autologous mouse plasma prepare in lab n/a Prepare per protocol step 2.4, use in  7.1 – mouse TI treatment administration
Autologous mouse serum prepare in lab n/a Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 – overnight culture of mouse PBMC
C57Bl/6J mice Jackson labs 0000664 Protocol steps 1, 2, 5 and 7 – mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um Medipoint 9891620 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Clear RPMI Gibco by LifeTech 11835-030 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
DMEM/F12 Gibco by LifeTech 11330-032 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
EasyGrip Petri Dishes, 35mm Falcon 351008 Protocol steps 5 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Eppendorf 1.5mL conical tubes DOT scientific 1700-GMT Protocol steps 1-8
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) SAFC Biosciences 12306C-500mL Protocol steps 1-4 – YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate
Hemavet 950FS hematology counter Drew Scientific HV950FS Protocol step 8.2 – monitoring human platelet numbers
Heparin 5,000U/mL McKesson Packaging services 949512 Protocol steps 2 and 8 – mouse and human PBMC preparation
Isoflurane Abbott Laboratories 5260-04-05 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Lympholyte M lymphocyte isolation medium Cedarlane Labs CL5035 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Non-essential amino acids Gibco by LifeTech 11140-050 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) Gibco by LifeTech 14190-144 Protocol steps 1-7
Pen/strep Gibco by LifeTech 15140-122 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Polypropylene 15mL conical tubes Falcon 352097 Protocol steps 1-8
Programmable 2-channel syringe pump New Era Pump Systems Inc model NE-4000 Protocol steps 4 and 8 – running the TI plate
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 BD Biosciences 305109 Protocol step 7 – mouse TI treatment administration
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) BD Biosciences 309604 Protocol steps 4, 8 – running the TI plate
Syringes, 1mL (Slip tip) BD Biosciences 309659 Protocol steps 1, 4, 7, 8
TI plate and tubing set Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
TI plate running platform Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) Falcon 353136 Protocol steps 1, 2, 6 and 8 – mouse and human cell culture
Tissue culture plates, 12-well Falcon 353043 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
Tissue culture scrapers Falcon 353085 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) Gibco by LifeTech 25200-056 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Tumor injection needles, 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Protocol step 1 – mouse subcutaneous tumor introduction
UVA irradiator Johnson and Johnson not commercially available  The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System Invitrogen fluorescence imaging instrument
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References

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Dendritic CellsPhysiologic Dendritic Antigen-presenting CellsPhDCMonocyte-to-DC ConversionPlatelet SignalingAnti-tumor T Cell ResponsesMonocyte-to-PhDC MaturationPeripheral Blood Mononuclear CellsPBMCRed Blood Cell LysisTumor-bearing Mice

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Citer Cet Article
Ventura, A., Vassall, A., Yurter, A., Robinson, E., Filler, R., Hanlon, D., Meeth, K., Ezaldein, H., Girardi, M., Sobolev, O., Bosenberg, M. W., Edelson, R. L. Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (147), e59370, doi:10.3791/59370 (2019).
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