体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

人間の Ips を含むすべての実験のプロトコルは、医学部と大学院医学部、京都大学の倫理委員会によって承認されました。 1. ヒト Ips 作製前に誘導 注:SNL フィーダーの文化人間 Ips (201B7-PAX3-GFP) 細胞16 4 ng/mL 組換えひと塩基性繊維芽細胞成長因子 (FGF2) と 0.5% ペニシリン ストレプトマイシンと補われる霊長類 ES 細胞用培地 (いう hESC 媒体として参照してください。表 1)。合流比 70%-80% に達すると上記17としてセルを通路します。 SNL フィーダー細胞17人間 Ips の継 通過、細胞培養皿に PBS を追加し、セルをすすいでください。その後、PBS を削除 (以下、このプロセスは PBS で洗浄剤としてとする)。 CTK 溶液 1 mL を追加 (表 1参照) 常温 (RT)、SNL フィーダー細胞は、皿の底からデタッチが開始されるまで待ちます。 CTK ソリューションを削除し、その後、PBS で 2 回洗います。 HESC 培地 1 mL を追加し、皿に、スクレーパーを使用して細胞をこすり、15 mL の円錐管に収集 (表 1参照)。 軽く 5 回 1,000 μ L チップを使用してコンテンツをピペット、悪名高く媒体でいっぱい新しい料理に譲渡。分割比率 1:4、1:10、通過前に合流比に応じてするを使用します。また、皿 (6 cm 皿、8 mL の 10 cm の皿のための例えば、3 mL) の規模によって悪名高く培地量が変わる。 37 ° C、5% CO2で人間の Ips を孵化させなさい。 (継翌日) を除く中毎日を変更し、次の passaging の手順まで、細胞の培養します。 PSM 誘導前に人間 Ips のフィーダー フリー培養注: 、SNL フィーダー細胞から分泌された成長因子の影響を最小限に抑える文化人間の Ips 細胞フィーダー フリー培養液とフィーダー無料条件の下で (表 1参照) (表 1参照) の細胞外マトリックス (ECM) ソリューションPSM 誘導前 3 日間被覆料理。 日-4 (PSM 誘導を開始する前に 4 日間) ECM ソリューション コーティング料理を準備には、一晩 4 ° C で 10 cm 皿に ECM ソリューションの 4 つの mL を追加します。注:氷の上を準備中の ECM ソリューションを配置します。 日-3 まず、お皿から ECM ソリューションを削除し、フィーダー フリー細胞培養液 8 mL を加えます。 フィーダー フリー培養を開始するには、リンスの培養細胞を PBS で 1 回洗浄します。 SNL フィーダー細胞は、皿の底からデタッチを開始するまで RT に CTK 溶液 1 mL を追加します。注:顕微鏡を使用して、すべてのフィーダー細胞は下から切り離されますを確認します。 CTK ソリューションを削除し、すべての SNL フィーダー細胞が完全に削除されますので、2 回、PBS で洗浄します。 料理に無料のフィーダー細胞培養液の 1 mL を追加し、スクレーパーを使用して細胞をこすり、15 mL の円錐管にまとめること。 ゆっくり 3 回 1,000 μ L チップを使用してコンテンツをピペット、(準備段階 1.2.1) 新しい ECM ソリューション コーティング 10 cm 皿に転送。1:4、フィーダー フリー培養前に合流比に応じて約 1:2 の分割比を使用します。 3 日間、日-1 に媒体を変更する 37 ° C、5% CO2で人間の Ips を孵化させなさい。 2. PSM 分化と蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えによる分離 PSM 分化 (日 0-4 日目) フィーダー フリー培養液を吸引し、PSM 誘導培地の 8 mL を追加 (10 μ M を添加した CDM 基礎培地 SB431542、10 μ M CHIR99021、2 μ M DMH1、および 20 ng/mL FGF2、表 1を参照してください)。注:PSM の分化の開始のセル合流地点誘導効率にとって重要です。顕微鏡を使用して、合流率は約 30% を確認します。 37 ° c、5% CO2セルを 4 日間、3 日目の媒体の変更にインキュベートします。 FACS のため 4 日 (セクション 2.2, の下) に細胞を収穫します。 蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え、DLL1 正 PSM 細胞の分離注: DLL1 陽性細胞の FACS を並べ替える前にセル準備のプロシージャを以下です。製造元のプロトコルに従って FACS は流れの cytometer を使用して並べ替えを実行します。 媒体を吸引し、PBS で洗浄します。その後、細胞解離試薬の 1 つの mL を追加し、右 3 分のまま CDM 基礎培地 4 mL を加えて、スクレーパーを使用して細胞をこすり 15 mL の円錐管にまとめること。 自動化された細胞カウンターを使用してセルの数をカウントし、3 分間 280 × gで遠心分離します。 慎重に吸引により上澄みを除去し、FACS バッファーに細胞を再懸濁します (表 1参照) 1.0 x 107セル/mL の濃度で。否定的な制御サンプル (アイソタイプ コントロールまたは抗体なしコンベンション)、15 mL の円錐管に 50 μ L を転送、FACS バッファーの 450 μ L で、停止します。 DLL1 抗体を追加 (材料の表を参照) 1/200 の割合で。光からチューブを守るし、氷上で 30 分間保持します。 280 x gで 3 分間遠心します。 慎重に、上清を吸引、FACS バッファー (1.0 x 107セル/mL) 1 mg/ml の DAPI 補完で再懸濁します。 チューブは氷の場所、並べ替えが完了するまでコレクションの管、フィルター、キャップの 35 μ m ナイロン メッシュを組み込んだに転送。否定的な制御サンプル (ステップ 2.2.4) と同じ手順を実行します。 製造元のプロトコルに従って流れの cytometer を使用して並べ替えを実行します。 Y27632 の 10 μ M を添加した CDM 基礎培地 4 mL を含む 15 mL の円錐管に並べ替えられた DLL1 陽性細胞を収集します。総 RNA の抽出、3 分 280 × gで遠心分離し、RNA の換散バッファーで再懸濁し、-30 ° C で保存RNA の抽出、逆のトランスクリプションおよび RT qPCR 手順 (セクション 5.1) より詳細な情報を参照してください。 並べ替えセルを用いた SM 分化を実行、以下のプロトコル (セクション 3)。 3. SM PSM から分化 並べ替えられた DLL1 正 PSM 細胞 (4 日 8 日目) から SM 分化注: ECM ソリューション コーティング 12 ウェル プレートに FACS を並べ替える前に一日を準備します。ECM ソリューション コーティング 12 ウェル プレートの準備 4 ° c を各ウェルに ECM ソリューションの 1 つの mL を追加し、一晩おきます。準備している間氷の上の ECM ソリューションを保持します。 次の 3 分間ステップ 2.2.10、280 × gで遠心します。 慎重に、上清を吸引し、SM 誘導培地 1 mL で再懸濁します (10 μ m CDM 基底培 SB431542 と 5 μ M CHIR99021、表 1を参照)。 自動化された細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。 SM 誘導培 Y27632 の 10 μ m の 1 mL を含む ECM ソリューション コーティング 12 ウェル プレートの各ウェルに種子 1.0 x 105セル。 5% CO2と 37 ° C で 8 日までの 4 日間インキュベートします。日 5 (FACS を並べ替えた後の日) と一日 7 Y27632 を含まない培地を変更します。 SM 誘導体分化細胞以下のプロトコルによると SM を使用してを実行します。SM この細胞からの総 RNA の抽出、15 mL の円錐管 280 x gで 3 分間遠心し、細胞を収集し、RNA の換散バッファーで再懸濁し、-30 ° C で保存 4 SM から SM (DM、墓、D、SCL、SYN) 誘導体分化 注:SM 細胞の全能力を示すためには、まず DM (dermomyotome) と SM の iPSC 由来細胞を使用してそれに応じて SCL (心) の誘導を実行します。その後、墓 (筋節) を行い、DM 細胞を用いた D (dermatome) 誘導と SCL 細胞を用いた SYN (syndetome) の誘導を行います。In vitro における各誘導体 (DM、墓、D、SCL、および SYN) SM この細胞からの誘導のためのプロトコルのとおりです。 SM 細胞 (8-日 11 日目) から DM 分化 媒体を吸引し、DM 誘導培地 1 mL を追加 (5 μ m CDM 基底培 CHIR99021 と 10 ng/mL BMP4、表 1を参照)。 11 日まで 3 日間の 37 ° c、5% の CO2とセルを孵化させなさい。10 日目 (日 DM 2 誘導) のメディアを変更します。 墓を実行し、以下のプロトコルによると DM 細胞を誘導 D による。 DM 細胞 (日 11 日 41) から墓の分化 、培地を吸引し、墓誘導培地 1 mL を追加 (5 μ M を添加した CDM 基礎培地 CHIR99021、表 1を参照)。 41 日まで 30 日間で 37 ° C、5% CO2セルを孵化させなさい。3 日ごとに媒体を変更します。 DM 細胞 (11 日 20 日目) から D 分化 媒体を吸引し、D 誘導培地 1 mL を追加 (5 μ m CDM 基底培 CHIR99021 と 10 ng/mL BMP4、表 1を参照)。 20 日まで 9 日間の 37 ° c、5% の CO2とセルを孵化させなさい。3 日ごとに媒体を変更します。 SM 細胞 (8-日 11 日目) からの SCL 分化 媒体を吸引し、SCL 誘導培地 1 mL を追加 (CDM 基底培 100 nM サグと 0.6 μ M LDN193189、表 1を参照)14。 3 日間の 37 ° c、5% の CO2とセルを孵化させなさい。10 日目 (日 SCL 2 誘導) のメディアを変更します。 SYN 分化細胞以下のプロトコルに従って SCL を使用してを実行します。 SCL 細胞 (日 11 日 32) から SYN 分化注: ECM ソリューション コーティング 24 ウェル プレートに SYN 誘導を開始する前に一日を準備します。ECM ソリューション コーティング 24 ウェル プレートを準備、4 ° c を各ウェルに ECM 溶液 0.5 mL を追加し、一晩おきます。準備している間氷の上の ECM ソリューションを保持します。 培地を吸引し、PBS で洗浄し、各ウェルに細胞解離試薬 0.2 mL を追加し、ルート 3 分のまま 各ウェルに CDM 基礎培地の 0.8 mL を追加し、こすりし、15 mL の円錐管にすべての電池を収集します。 280 x gで 3 分間遠心します。 慎重に、上清を吸引し、SYN 誘導媒体 1 の 1 mL で再懸濁します (20 ng/ml、FGF8 CDM 基底培は、表 1を参照)、その後、自動化された細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。 1 SYN 誘導培地 1 mL を含む ECM ソリューション コーティング 24 ウェル プレートの各ウェルに種 5.0 × 104セルです。 37 ° c、5% の CO2と 3 日間インキュベートします。 SYN 誘導中 2 に置き換えます日 14 (日 SYN 3 誘導)、媒体 (10 ng/mL BMP7 と 10 ng/mL TGFβ3、CDM 基底培は、表 1を参照)。 37 ° c、5% CO232 日まで 18 日間インキュベートします。3 日ごとに媒体を変更します。 5. iPSC 由来物のキャラクタリゼーション 注:分化に量的なリアルタイム PCR (RT qPCR)、免疫細胞化学 (ICC)、酵素抗体法 (ELISA)、機械的ストレッチ刺激試金をそれに応じて使用人間 Ips の誘導体を特徴付けます。 セル収穫、総 RNA の抽出、逆のトランスクリプション、定量的リアルタイム PCR (RT qPCR) 1.5 mL チューブに細胞サンプル (5.4.3 3.1.6、2.2.10、(プロシージャ) を収集し、3 分間 280 × gで遠心分離機します。 、上清を除去し、適切なトータル RNA の抽出キットによって提供される RNA 換散バッファーの 350 μ L で再懸濁します。 製造元のプロトコルに従ってキットを使用して総 RNA を抽出します。 逆は、製造元のプロトコルに従って cDNA への総 RNA の隔離の 1 μ g を書き写します。 RT qPCR 適切な酵素、試薬、製造元のプロトコルに従ってプライマーを使用してを実行します。表2 本研究で使用されるプライマー シーケンスのとおりです。 免疫細胞化学 (ICC) 抗体を用いた免疫細胞化学を実行する、前に 10 分、4 ° C で 2% パラホルムアルデヒドとセルを修復する、PBS で 2 回洗ってください。 透過性、4 ° C 15 分で 0.2% メタノールまたは 0.2% ポリソルベート 20/PBS (PBS T という) 孵化させなさい。 透過試薬を削除し、適切なブロック バッファーまたは 1% ウシ血清アルブミン/PBS で 4 ° C, 60 分で細胞を治療します。 一晩 PBS T と 4 ° C で振動マシン上の場所のブロック バッファーを 10% に希釈した最初の抗体を追加します。 PBS T と 3 回洗浄 (PBS T を追加し、10 分間振動マシン RT 時に配置)。 PBS T と 60 分間常温振動マシン上の場所のブロック バッファーを 10% に希釈した 2 番目の抗体を追加します。本研究で使用される ICC の最初と 2 番目の抗体は、表 3のとおりです。注:このステップからホイルで包むことによってライトからプレート/皿を保護します。 PBS”T”で 2 回洗う カウンターは染色、PBS と 5 分間常温振動マシン上の場所で希釈 1/5000 DAPI を追加します。 DAPI のソリューションを削除し、各ウェルに PBS を追加します。 蛍光顕微鏡を用いた細胞染色を観察します。また、1 ヶ月の 4 ° C でプレート/皿を格納します。 D の iPSC 由来の機能解析のための酵素免疫測定法 (ELISA)注:ひと真皮線維芽細胞 (HDF) 市販されています。10% 牛胎児血清を DMEM で HDF を文化 (表 1参照)。 各培養液 1 mL を含む 24 ウェル プレートに iPSC 由来 D と HDF の種子 1.0 x 105セル (:d 誘導培地、HDF: 10% 牛胎児血清を DMEM)。 1.5 mL チューブに配置し、4 ° C で保存後, 培養細胞の 3 日間は、各媒体の 100 μ L を収集 製造元の指示に従って一連のプロシージャ、検出抗体、二次抗体の追加などを実行し、コントロールの濃度に対して標準的な曲線を生成することでターゲットの数を定量化します。検体サンプル。 SYN の iPSC 由来の機能解析のための機械的ストレッチ刺激アッセイ注:大人の人間の線が市販 (材料の表を参照してください)。文化人間 iPSC 由来 SYN と18,19以下のとおりストレッチ機械的ストレッチ刺激測定装置のセルに大人の人間線。SYN 誘導の中 2 と線成長媒体の使用 (材料表参照) 各 iPSC 由来 SYN と大人の人間の線の培養培地としてそれぞれ。 ストレッチ前に 24 h で、iPSC 由来 SYN の ECM ソリューション コーティング マルチ井戸型シリコン ラバーに人間線板 1.0 x 105セル室、それぞれ 1.5 cm × 1.5 cm の文化面 (材料の表を参照してください)。 セルの伸張のためのデバイスのチャンバーを設定し、強制的に一軸ひずみ (0.5 Hz、5%)12 時間。 総 RNA の抽出、RNA 換散バッファーの 350 μ L を追加し、こすりし、総 RNA の抽出とその後の RT qPCR 分析 (手順 5.1 参照) を 1.5 mL チューブに細胞を収集します。