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Bio-ingénierie

Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

Published: May 13, 2019
doi:
10.3791/59324
1Biology Department,Luminex Corporation

Summary

El ensayo de micronúcleos in vitro es un método bien establecido para evaluar la genotoxicidad y la citotoxicidad, pero la puntuación del ensayo mediante microscopía manual es laboriosa y sufre de subjetividad y variabilidad entre marcadores. Este documento describe el protocolo desarrollado para realizar una versión totalmente automatizada del ensayo utilizando citometría de flujo de imágenes multiespectral.

Abstract

El ensayo de micronúcleos in vitro (MN) se utiliza a menudo para evaluar la citotoxicidad y la genotoxicidad, pero la puntuación del ensayo mediante microscopía manual es laboriosa e introduce incertidumbre en los resultados debido a la variabilidad entre los marcadores. Para remediar esto, se han introducido microscopías automatizados de escaneo de diapositivas, así como métodos convencionales de citometría de flujo, en un intento de eliminar el sesgo del marcador y mejorar el rendimiento. Sin embargo, estos métodos tienen sus propias limitaciones inherentes, como la incapacidad para visualizar el citoplasma de la celda y la falta de verificación visual de MN o almacenamiento de datos de imagen con citometría de flujo. La citometría de flujo de imágenes multiespectrales (MIFC) tiene el potencial de superar estas limitaciones. MIFC combina las imágenes fluorescentes de alta resolución de la microscopía con la robustez estadística y la velocidad de la citometría de flujo convencional. Además, todas las imágenes recopiladas se pueden almacenar en archivos específicos de dosis. Este documento describe el protocolo desarrollado para realizar una versión totalmente automatizada del ensayo MN en MIFC. Las células TK6 linfoplóstoides humanas se agrandaron utilizando una solución hipotónica (75 mM de KCl), fijadas con un 4% de formalina y el contenido nuclear se tiñó con Hoechst 33342. Todas las muestras se ejecutaron en suspensión en el MIFC, lo que permitió la adquisición de imágenes de alta resolución de todos los eventos clave necesarios para el ensayo (por ejemplo, células binucleadas con y sin MN, así como células mononucleadas y polinucleadas). Las imágenes se identificaron, clasificaron y enumeraron automáticamente en el software de análisis de datos MIFC, lo que permite la puntuación automatizada de la citotoxicidad y la genotoxicidad. Los resultados demuestran que el uso de MIFC para realizar el ensayo in vitro de MN permite detectar aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia de MN en varios niveles diferentes de citotoxicidad en comparación con los controles de disolvente según la exposición de células TK6 a La mitomicina C y la colchicina, y que no se observan aumentos significativos en la frecuencia de mN después de la exposición a Mannitol.

Introduction

El ensayo de micronúcleos in vitro (MN) es un ensayo de uso común para evaluar la citotoxicidad y la genotoxicidad como herramienta de cribado en varios campos de estudio, como el desarrollo químico y farmacéutico, así como la biomonitorización humana entre individuos expuestos a factores ambientales, ocupacionales o de estilo de vida1,2,3. El MN consiste en fragmentos cromosómicos o cromosomas enteros generados durante la división celular que no se incorporan a uno de los dos núcleos principales de la hija. Después de la telofase, este material cromosómico se forma en un cuerpo individual y redondeadodentro del citoplasma que es independiente de cualquiera de los núcleos principales 2. Por lo tanto, MN son representativos de los daños en el ADN y se han utilizado durante muchos años como punto final en las pruebas de genotoxicidad4. El método más adecuado para medir la MN es el ensayo del micronúcleo de bloque de citoquinesis (CBMN). Usando el ensayo CBMN, la frecuencia de MN en células binucleadas (BNC) se puede puntuar incorporando Cytochalasin B (Cyt-B) en la muestra. Cyt-B permite la división nuclear pero previene la división celular y por lo tanto, restringe la puntuación de MN a bNCs que se han dividido sólo una vez5.

Los protocolos que utilizan la microscopía y la citometría de flujo han sido desarrollados y validados y se utilizan rutinariamente para realizar el ensayo in vitro MN6,7,8,9,10, 11,12,13,14. La microscopía se beneficia de ser capaz de confirmar visualmente que la MN es legítima, pero consume mucho tiempo y es propensa a la variabilidad entre los marcadores15. Para hacer frente a esto, se desarrollaron métodos automatizados de microscopía para escanear diapositivas y capturar imágenes de núcleos y MN16,17,18,19, pero el citoplasma no se puede visualizar, por lo que no se puede visualizar, por lo que difícil de determinar si un MN está realmente asociado a una celda específica. Además, estos métodos tienen dificultades para identificar células polinucleadas (POLY) (incluidas las células trinucleadas y cuadrácidas) que son necesarias para el cálculo de la citotoxicidad cuando se utiliza Cyt-B9. Los métodos de citometría de flujo desarrollados para realizar el ensayo MN emplean fluorescencia, así como intensidades de dispersión hacia adelante y laterales para identificar poblaciones de los núcleos y MN que han sido liberadas de la célula después de la lisis20,21 ,22. Esto permite que los datos se adquieran de varios miles de células en pocos minutos y permite el análisis automatizado23; sin embargo, la incapacidad de visualizar las celdas hace que sea imposible confirmar que los eventos puntuados son genuinos. Además, el lising de la membrana celular inhibe el uso de Cyt-B, así como la creación de una suspensión que contiene otros desechos como agregados cromosómicos o cuerpos apoptoticos y no hay manera de diferenciarlos de MN24.

A la luz de estas limitaciones, Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) es un sistema ideal para realizar el ensayo MN ya que combina las imágenes fluorescentes de alta resolución de la microscopía con la robustez estadística y la velocidad de la citometría de flujo convencional. En MIFC, todas las células se introducen en un sistema de fluidos y luego se centran hidrodinámicamente en el centro de una cubeta de celda de flujo. La iluminación ortogonal de todas las células se logra mediante el uso de un diodo emisor de luz (LED) de campo brillante (BF), un láser de dispersión lateral y (al menos) un láser fluorescente. Los fotones fluorescentes son capturados por una de las tres lentes objetivos de alta apertura numérica (20x, 40x o 60x) y luego pasan a través de un elemento de descomposición espectral. Los fotones se centran en una cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD) para obtener imágenes de alta resolución de todas las celdas que pasan a través de la celda de flujo. Para evitar desenfoqueoo o rayado, el CCD funciona en modo de integración de retardo de tiempo (TDI) que realiza un seguimiento de los objetos mediante la transferencia de contenido de píxeles de fila a fila hacia abajo el CCD en sincronía con la velocidad de la celda en flujo. A continuación, la información de píxeles se recopila de la última fila de píxeles. Las imágenes TDI combinadas con la descomposición espectral permiten capturar hasta 12 imágenes (2 BF, 10 fluorescentes) simultáneamente de todas las células que pasan a través de la célula de flujo. Todas las imágenes capturadas se almacenan en archivos de datos específicos de la muestra, lo que permite realizar análisis en cualquier momento utilizando el software de análisis de datos MIFC. Por último, los archivos de datos conservan el vínculo entre las imágenes celulares y los puntos en todas las gráficas bivariadas. Esto significa que cualquier punto en una gráfica bivariada tradicional se puede resaltar y sus correspondientes imágenes BF e fluorescentes se mostrarán25.

Recientemente, se han desarrollado métodos basados en MIFC para realizar el ensayo MN tanto para biodosimetría de radiación de triaje26,27,28,29,30,31 y genética toxicología32,33 pruebas. Este trabajo ha demostrado que las imágenes celulares de los núcleos principales, MN y el citoplasma se pueden crear imágenes con un mayor rendimiento que otros métodos26. Todos los tipos de celdas necesarios para el análisis, incluidas las células MONO, las BNC (con y sin MN) y las células POLY, se pueden identificar automáticamente en el software de análisis de datos MIFC, y la implementación de los criterios de puntuación desarrollados por Fenech et al. se logra a través de el uso de varios algoritmos matemáticos6,34. Los resultados de la biodosimetría mostraron que las curvas de calibración de la respuesta a la dosis eran similares en magnitud a las obtenidas de otros métodos automatizados en la literatura al cuantificar la tasa de MN por BNC29. Además, los trabajos recientes en toxicología demostraron que las imágenes de células MONO, BNCs (con y sin MN) y células POLY pueden capturarse, identificarse, clasificarse y enumerarse automáticamente utilizando MIFC. El protocolo y el análisis de datos permitieron el cálculo de la citotoxicidad y la genotoxicidad después de exponer las células TK6 a varios clastógenos y aneugens32.

El protocolo presentado en este documento describe un método para realizar el ensayo de MN in vitro utilizando MIFC. La técnica de procesamiento de muestras utilizada en este trabajo requiere menos de 2 h para procesar una sola muestra y es relativamente fácil de realizar en comparación con otros métodos. El análisis de datos en el software de análisis MIFC es complicado, pero la creación de la plantilla de análisis se puede realizar en unas pocas horas siguiendo los pasos descritos en este documento. Además, una vez creada la plantilla, se puede aplicar automáticamente a todos los datos recopilados sin ningún otro trabajo. El protocolo describe todos los pasos necesarios para exponer las células TK6 a clastógenos y aneugens, describe cómo cultivar, procesar y manchar las celdas, y demuestra cómo adquirir imágenes de alta resolución mediante MIFC. Además, este documento ilustra las mejores prácticas actuales para analizar datos en el software MIFC para identificar y puntuar automáticamente células MONO, BNC y células POLY con el fin de calcular tanto la citotoxicidad como la genotoxicidad.

Protocol

1. Preparación del medio de cultivo y cultivo de células TK6 NOTA: Algunos productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos. Inhalar, tragar o entrar en contacto con la piel con cytochalasina B puede ser mortal. Use el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una capa de laboratorio y dos pares de guantes de nitrilo. Lávese bien las manos después de manipularlas. La formalina/formaldehído es tóxica si se inhala o se ingiere; es irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel; y puede causar sensibilización por inhalación o contacto con la piel. Existe el riesgo de daños graves en los ojos. Es un carcinógeno potencial. Preparar 565 ml de 1 medio de cultivo RPMI. Añadir 5 ml de aminoácidos no esenciales MEM (100x), 5 ml de piruvato sódico (100 mM), 5 ml de penicilina-estreptomicina-glutamina (100x) y 50 ml de suero bovino fetal (FBS) a una botella de 500 ml de 1x RPMI 1640 medio. Preparar el medio en un armario de bioseguridad y almacenarlo a 2-8oC. Calentar el medio a 37 oC antes de añadirlo a las celdas TK6 (ver Tabla de Materiales). Descongelar 1 ml de células TK6 (almacenadas a -80 oC en DMSO) en 10 ml de medio. Centrifugar las células a 200 x g durante 8 min y aspirar el sobrenadante. Transfiera las células a 50 ml de medios e incubara 37 oC, 5% CO 2. El tiempo de duplicación de las células TK6 varía de 12-18 h y se necesitarán algunos (3 o 4) pasajes para que las células alcancen su tasa máxima de proliferación (ver Tabla de Materiales). Cultivo de 100 ml de células a una concentración de 7-8 x 105 células/ml. 2. Preparación de clastógenos y/o aneugens y citochalasina B Preparar las concentraciones de stock adecuadas de clastógenos y aneugens deseados. Por ejemplo, para la mitomicina C, disolver un frasco completo de 2 mg en 10 ml de agua estéril para lograr una concentración final de stock de 200 g/ml. La mitomicina C se puede almacenar a 4oC durante tres meses (ver Tabla de Materiales). El día del experimento, prepare diluciones de los productos químicos deseados que sean 10 veces o 100 veces más altas que las concentraciones de exposición deseadas si se diluyen en agua estéril o DMSO, respectivamente. Para la mitomicina C, preparar diluciones de 3 ml en agua estéril de 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 y 5,0 g/ml. Para La colchicina, prepare diluciones de 3 ml en agua estéril de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 g/ml. Por último, para Mannitol, preparar diluciones de 3 ml en agua estéril de 5, 10, 20, 30, 40 y 50 mg/ml. Preparar una concentración de stock de 200 g/ml de cytochalasina B disolviendo un frasco de 5 mg en 25 ml de DMSO. La citochalasina B se puede almacenar a -20 oC durante varios meses. 3. Exposición de células a clastógenos y/o aneugens Añadir 1 ml de sustancia química deseada (p. ej., mitomicina C) a 9 ml de células a 7-8×105 células/ml en un matraz T25. Para las muestras de control, añadir 1 ml de agua estéril. Colocar los matraces en una incubadora de CO2 de 37oC, 5% durante 3 h.NOTA: Si los productos químicos se diluyen en DMSO, agregue sólo 100 l de la sustancia química a cada matraz y agregue 100 ml de DMSO a los controles. Cada matraz debe contener 9.900 ml de células. Después de 3 h, retire los matraces de la incubadora y transfiera las células a tubos de polipropileno de 15 ml. Centrífuga a 200 x g durante 8 min, aspirar el sobrenadante y transferir las células a nuevos matraces T25 que contengan un total de 10 ml de medio de cultivo fresco. Añadir 150 l de concentración de stock (200 g/ml) de citochalasina B a cada matraz para alcanzar una concentración final de 3 g/ml. Devolver los matraces a la incubadora de 37oC, 5% co2 para un tiempo de recuperación igual a 1,5-2,0 veces de duplicación, según lo recomendado por las directrices de la OCDE9. Para las células TK6 utilizadas en este trabajo, el tiempo de recuperación fue de 24 h.NOTA: El tiempo de duplicación de las células TK6 utilizadas aquí fue de 15 h y se utilizó un tiempo de recuperación de 24 h (1,6 veces de duplicación). Los tiempos de recuperación inferiores a 1,5 veces de duplicación reducirán la proliferación en muestras expuestas a dosis más altas que afectan al número de BNCs. Por el contrario, los tiempos de recuperación de más de 2,0 producirán un número desproporcionado de células polinucleadas en las muestras de control, sesgar los cálculos de citotoxicidad. 4. Preparación de tampones para la fijación y etiquetado del contenido de ADN (ver Tabla de Materiales) Preparar 75 mM de cloruro de potasio (KCl) añadiendo 2.79 g a 500 mL de agua ultrapura. Revuelva la solución durante 5 minutos utilizando un agitador magnético y un filtro estéril a través de un filtro de 200 m. La solución KCl de 75 mM se puede almacenar a 4 oC durante varios meses. Preparar una cantidad suficiente de 4% de formalina para el experimento, anticipando que se debe añadir un total de 2,1 ml a cada muestra. Por ejemplo, para preparar 10 ml de 4% de formalina, agregue 4 ml de 10% de material de formalina a 6 ml de 1 solución salina con fosfato de Dulbecco sin Ca2+ o Mg2+ (PBS). Esta formalina del 4% se puede almacenar a temperatura ambiente durante varias semanas. Prepare 510 ml de tampón de lavado (2% FBS en 1X PBS) añadiendo 10 ml de FBS a una botella de 500 ml de 1PBS. Preparar 10 ml de una concentración de 100 g/ml de Hoechst 33342 añadiendo 100 ml de la concentración de stock (1 mg/ml) a 9.900 ml de 1X PBS. La solución Hoechst 33342 se puede almacenar a 4 oC durante varios meses. 5. Procesamiento de muestras: hinchazón hipotónica, fijación, conteo celular y etiquetado de contenido de ADN Al final del período de recuperación, retire todos los matraces de la incubadora y transfiera todas las muestras a tubos de polipropileno de 15 ml. Centrifugar todas las muestras a 200 x g durante 8 min. Aspirar el sobrenadante, resuspender las células y añadir 5 mL de 75 mM KCl. Mezclar suavemente mediante la inversión tres veces e incubar a 4 oC durante 7 min. Añadir 2 ml de formalina al 4% de la formalidad a cada muestra, mezclar suavemente por inversión tres veces e incubar a 4 oC durante 10 min. Este paso actúa como una “fijación suave”. Centrifugar todas las muestras a 200 x g durante 8 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 100 l de formalina del 4% durante 20 min. Este paso actúa como una “fijación dura”. Añadir 5 ml de tampón de lavado y centrífuga a 200 x g durante 8 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 100 ml de tampón de lavado. Transfiera todas las muestras a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Realice un recuento de celdas en cada muestra para determinar el número de celdas por muestra. Las muestras estarán altamente concentradas, por lo que es probable que se requiera una dilución de 1:100 en 1x PBS (10 ml de muestra en 990 ml de PBS) para obtener un recuento preciso.NOTA: En este punto es mejor realizar recuentos de celdas utilizando un hemocitómetro. La adición de KCl le da al citoplasma un aspecto translúcido, lo que dificulta que los contadores de células automatizados los reconozcan. Además, los contadores automatizados tienen dificultad para puntuar celdas polinucleadas debido a su tamaño. Si no se ejecutan las muestras en el MIFC inmediatamente, se pueden almacenar a 4 oC durante varios días. Cuando esté listo para ejecutar muestras, agregue 5 sL de 100 g/ml por 1×106 celdas/ml a cada muestra. También añadir 10 éL de 500 g/ml de RNase por cada 100 ml de muestra para una concentración final de 50 g/ml. Incubar las muestras a 37oC, 5%CO2 durante 30 min. Microcentrifugar todas las muestras a 200 x g durante 8 min y utilizar una pipeta para retirar el sobrenadante dejando 30 sL. Utilice una pipeta para resuspender todas las muestras antes de correr en el MIFC asegurándose de que no haya burbujas en el tubo. No vórtice. 6. Inicio y calibración del MIFC Asegúrese de que la vaina, el reactivo de calibración del sistema, el desburbujante, el limpiador y los contenedores esterilizadores estén llenos y que el depósito de residuos esté vacío. Encienda el sistema y haga doble clic en el icono del software MIFC. Haga clic en el botón Inicio y asegúrese de que la casilla Iniciar todas las calibraciones y pruebas esté activada. Esto vaciará el sistema, la funda de carga y los reactivos de calibración del sistema, y calibrará el sistema (consulte Tabla de materiales). 7. Ejecución de muestras en el MIFC NOTA: Esta sección asume el uso de un MIFC de 2 cámaras. Si utiliza un MIFC de 1 cámara, consulte Suplemento 1 – Protocolo completo, sección 7 para la creación de parcelas durante la adquisición Inicie el software de adquisición de datos MIFC (consulte Tabla de materiales). La Figura 1 muestra la configuración del instrumento. Encienda el láser de 405 nm y ajuste la potencia del láser a 10 mW (A). Inhabilite todos los demás láseres (incluido SSC) y ajuste el BF a los canales 1 y 9 (B). Confirme que el control deslizante de ampliación está establecido en 60x (C), se selecciona el modo de alta sensibilidad (D) y que solo se muestran los canales 1, 7 y 9 en la galería de imágenes. Haga clic en el icono Trazado de dispersión. Seleccione Toda la población y seleccione Area M01 en el eje X y Relación de aspecto M01 en el eje Y. Haga clic en el icono Región cuadrada y dibuje una región alrededor de las celdas individuales. Asigne a esta región el nombre Celdas únicas. Haga clic con el botón derecho en el trazado y seleccione Regiones. Resalte la región Celdas únicas y cambie las coordenadas x a 100 y 900 y cambie las coordenadas Y a 0,75 y 1 (Figura1I). Haga clic en el icono Trazado de dispersión. Seleccione Celdas únicas como población primaria, seleccione Gradient RMS M01 en el eje X y Degradado RMS M07 en el eje Y. Haga clic en el icono Región cuadrada y dibuje una región alrededor de la mayoría de las celdas. Asigne a esta región el nombre Celdas enfocadas. Haga clic con el botón derecho en el trazado y seleccione Regiones. Resalte la región Células enfocadas y cambie las coordenadas x a 55 y 75 y cambie las coordenadas y a 9.5 y 20 (Figura1J). Haga clic en el icono Histograma. Seleccione la población Células enfocadas y seleccione Intensidad M07 como entidad. Haga clic en el icono Región lineal y dibuje una región a través del pico principal del histograma. Nombre esta región DNA-positivo. Haga clic con el botón derecho en el trazado y seleccione Regiones. Resalte la región de ADN positivo y cambie las coordenadas a 2 x 105 y 2 x 106. El rango puede tener que ajustarse dependiendo del pico de intensidad en el histograma (Figura1K). Establezca los parámetros de adquisición (Figura1E). Especifique el nombre de archivo y la carpeta de destino, cambie el número de eventos a 20.000 y seleccione la población de ADN positivo. Haga clic la carga (figura1F)y coloque la muestra de control en el MIFC. Haga clic en el botón Adquirir para recopilar los datos (figura1G). Una vez completada la adquisición, haga clic en el botón Retorno para devolver el ejemplo (Figura1H). Retire el tubo de muestra del instrumento. Repita este proceso para todas las muestras restantes del experimento. 8. Abrir un archivo de datos en IDEAS Inicie el paquete de software de análisis MIFC (consulte la Tabla de materiales). Haga clic en Iniciar análisis para iniciar el Asistente para abrir archivos. Seleccione un archivo de datos navegando hasta el archivo de imagen sin procesar deseado (.rif). Haga clic en el botón Abrir y haga clic en Siguiente. Puesto que se trata de un ensayo de un solo color, la compensación no es necesaria, así que haga clic en Siguiente para omitir el paso de compensación. En esta etapa no hay ninguna plantilla de análisis para aplicar, así que haga clic en Siguiente de nuevo. Si la plantilla de análisis se ha descargado del material complementario, selecciónela ahora. Estas plantillas solo funcionan con un MIFC de 2 cámaras con BF establecido en los canales 1 y 9 e imágenes nucleares en el canal 7 durante la adquisición. De forma predeterminada, los nombres de archivo .cif y .daf se generan automáticamente para que coincidan con el archivo .rif. No se recomienda cambiar los nombres de .cif y .daf. Haga clic en Siguiente. Establezca las propiedades de visualización de la imagen seleccionando los archivos 01 y 07. Haga clic en Siguiente. No hay ningún asistente para esta aplicación, así que haga clic en Finalizar. Es muy importante guardar el archivo de análisis de datos (.daf) y la plantilla de análisis (.ast) a menudo durante las secciones 9–14 para evitar la pérdida de progreso. 9. Creación de máscaras y características para identificar bNCs Haga clic en el icono Propiedades de la Galería de imágenes (icono azul/blanco). En la pestaña Propiedades de visualización, haga clic en Establecer rango en datos de píxel y, a continuación, cambie el color a amarillo. Haga clic en Aceptar. Las imágenes de Hoechst ahora son más fáciles de ver contra el fondo negro. Cree el trazado de celdas no apoptoticas. Haga clic en la pestaña Análisis y, a continuación, haga clic en Máscaras. Haga clic en Nuevo y, a continuación, en Función. En Function (Función), elija Threshold(Umbral), en Mask (Máscara), elija M07 (M07) y establezca el Porcentaje de intensidad en 50. Haga clic en Aceptar y luego en Aceptar de nuevo. Haga clic en Cerrar. Haga clic en la pestaña Análisis, haga clic en Característicasy, a continuación, haga clic en Nuevo. Para el tipo de operación, seleccione Area. En Máscara, seleccione Umbral(M07,Ch07,50). Haga clic en Establecer nombre predeterminado y haga clic en Aceptar. Haga clic en Cerrar para empezar a calcular los valores de entidad. Haga clic en el icono Gráfica de puntos. Seleccione La población Todos. Para la función Del eje X, elija la función Contrast_M01_Ch01 y, para la función Del eje Y, elija Area_Threshold(M07,Ch07,50). Haga clic en Aceptar. Haga clic en el botón Región cuadrada y dibuje una región alrededor de la mayoría de las celdas. Llame a esta región No apoptotic. Haga clic con el botón derecho en el trazado y haga clic en Regiones. Resalte la región No apoptotica. Establezca las coordenadas x en 0 y 15 y establezca las coordenadas y en 50 y 300. Haga clic en Cerrar. Cree la máscara BNC (pasos 9.3.1-9.3.5) para identificar las células que contienen solamente dos núcleos. Busque un BNC en la galería de imágenes y haga clic en él. Esto es para visualizar la creación de la máscara en el canal Hoechst. Haga clic en la pestaña Análisis y, a continuación, haga clic en Máscaras. Haga clic en Nuevo y, a continuación, en Función. En Function (Función), elija LevelSet ( LevelSet),(Máscara), elija M07(Máscara) y seleccione el botón de opción Middle Level Mask (Máscara de nivel medio) y establezca la Escala de detalles de contorno en 3.00. Haga clic en Aceptar y luego en Aceptar de nuevo. Haga clic en Nuevo y, a continuación, en Función. En Function( Function), elija Dilate( Dilate) y, en Mask (Máscara), elija LevelSet(M07,Ch07,Middle,3). Establezca la imagen para que se muestre en Ch07y el número de píxeles en 2. Haga clic en Aceptar y luego en Aceptar de nuevo. Haga clic en Nuevo y, a continuación, en Función. En Function (Función), elija Watershed (Cuenca hidrográfica)y, en Mask (Máscara), elija Dilate(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)2). Establezca la imagen para que se muestre en Ch07y establezca el Grosor de línea en 1. Haga clic en Aceptar y luego en Aceptar de nuevo. Haga clic en Nuevo y, a continuación, en Función. En Function (Función), elija Range( Range), (Máscara), elija Watershed(Dilate(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)2)). Establezca la imagen para que se muestre en Ch07. Establezca los valores de área mínimo y máximo en 115 y 5000, respectivamente. Establezca los valores de relación de aspecto mínimo y máximo en 0,4 y 1, respectivamente. Haga clic en Aceptar. En el campo Nombre, cambie el texto para leer BNC y, a continuación, haga clic en Aceptar. Crear las características y parcelas para obtener la población BNC final Función BNC de recuento de puntos: haga clic en la pestaña Análisis, luego en Característicasy, a continuación, en Nuevo. Para el Tipo de operación, seleccione Recuento de puntos. En Máscara, seleccione la máscara BNC final creada en 9.3.5. Establezca La Conexión en Cuatro y cambie el nombre a BNC de recuentopuntual . Haga clic en Aceptar y, a continuación, en Cerrar para calcular los valores de entidad. Histograma BNC de recuento de puntos. Haga clic en el icono Histograma. Seleccione No apoptotico como la población primaria. Para la función del eje X, elija la función BNC de recuento de puntos. Haga clic en Aceptar. Haga clic en el icono Región lineal. Dibuje una región en la bandeja 2. Llame a esta región 2N.NOTA: Consulte la sección 9 del Suplemento 1 – Protocolo completo para crear las máscaras, características y parcelas restantes para identificar la población final de BNC 10. Creación de máscaras y características para identificar el MN dentro de la población de BNC Cree la máscara MN. Busque un BNC que contenga un MN en la galería de imágenes y haga clic en él. Esto es para visualizar la creación de la máscara MN en el canal Hoechst. Haga clic en la pestaña Análisis y, a continuación, haga clic en Máscaras. Crear máscara de identificación de punto 1: Haga clic en Nuevo y, a continuación, en Función. En Function (Función), elija Spot (Punto) y asegúrese de que el botón de opción Bright (Brillo) esté seleccionado. En Máscara, elija M07, establezca la Relación de fondo de spot en celda en 2.00. Establezca el Radio mínimo en 2 y el Radio Máximo en 6. Haga clic en Aceptar y luego en Aceptar de nuevo. Haga clic en Nuevo y, a continuación, en Función. En Function (Función), elija Range(Rango) y, en Mask (Máscara), elija LevelSet(M07,Ch07,Middle,3). Establezca la imagen para que se muestre en Ch07. Establezca el área mínima y máxima en 80 y 5000, respectivamente. Establezca la Relación de aspecto mínimo y máximo en 0 y 1, respectivamente. Haga clic en Aceptar y luego en Aceptar de nuevo. Haga clic en Nuevo y, a continuación, en Función. En Function (Función), elija Dilate ( Dilate), (Máscara), elija Range(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3),80-5000,0-1). Establezca la imagen para que se muestre en Ch07. Establezca el Número de píxeles en 2. Haga clic en Aceptar y luego en Aceptar de nuevo. Haga clic en Nuevo. Haga doble clic en la máscara Spot(M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) para agregarla a la definición de máscara. Haga clic en el operador And y, a continuación, en el operador Not. Haga doble clic en la máscara Dilate(Range(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2) para agregarla a la definición de máscara. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Nuevoy, a continuación, en Función. Bajo función elija el rango y bajo la máscara elija la máscara creada en 10.1.1.4: Seleccione Spot(M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) y Not Dilate(Range(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2). Establezca la imagen en Visualización en Ch07. Establezca el área mínima y máxima en 10 y 80, respectivamente. Establezca la Relación de aspecto mínimo y máximo en 0,4 y 1, respectivamente. Haga clic en Aceptar y luego en Aceptar de nuevo. La máscara de identificación de punto 1 está completa.NOTA: Consulte la sección 10 del Suplemento 1 – Protocolo completo para crear las máscaras, características y parcelas para identificar la población final de MN 11. Crear máscaras, características y parcelas para identificar las poblaciones mononucleadas y polinucleadas Cree la máscara POLY. Haga clic en Análisis, luego en Máscarasy, a continuación, en Nuevo . En Function (Función), elija Range(Rango), en Mask (Máscara), elija Watershed(Dilate(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 2)). Establezca la imagen para que se muestre en Ch07. Establezca los valores de área mínima y máxima en 135 y 5000, respectivamente. Establezca los valores de Relación de aspecto mínima y máxima en 0,4 y 1, respectivamente. Haga clic en Aceptar. En el campo Nombre, cambie el texto para leer POLY y, a continuación, haga clic en Aceptar y, a continuación, en Cerrar. La máscara de celda polinucleada está completa. Cree las máscaras de componentes POLY. POLI Máscara de componente 1: Haga clic en la pestaña Análisis, luego Máscaras, luego Nuevo, luego Función. En Función, seleccione Componentey, en Máscara, seleccione la máscara POLY. En Función de clasificación, seleccione Areay, Orden de clasificación, haga clic en el botón de opción Descendente. Establezca Rango en 1. Haga clic en Aceptar y luego en Aceptar de nuevo. Polimáscaras de componentes 2, 3 y 4: Repita todos los pasos de 11.2.1 excepto establecer Rango en 2, 3 y 4 para crear las máscaras de componentes individuales. Recuento de puntos mediante la máscara POLY. Haga clic en la ficha Análisis y, a continuación, en Característicasy, a continuación, en Nuevo. En Tipo de operación, seleccione Recuento de puntos. En Mask, elija la máscara POLY y establezca Connectedness en 4. Haga clic en Establecer nombre predeterminado y haga clic en Aceptar y, a continuación, en Cerrar para calcular los valores de entidad. Haga clic en el icono Histograma. Seleccione la población no apoptotica. Para la función del eje X, elija la función Recuento de puntos_POLY_4. Región de recuento de puntos MONO. Haga clic en el icono Región lineal. Dibuje una región en la bandeja 1 del histograma creado en 11.3.2. Llame a esta región 1N. Región de recuento de puntos TRI. Haga clic en el icono Región lineal. Dibuje una región en la bandeja 3 del histograma creado en 11.3.2. Llame a esta región 3N. REGIÓN de recuento de puntos QUAD MONO. Haga clic en el icono Región lineal. Dibuje una región en la bandeja 4 del histograma creado en 11.3.2. Llame a esta región 4N. Identificar la población MONO. Cree la función DE relación de aspecto MONO. Haga clic en la ficha Análisis y, a continuación, en Característicasy, a continuación, en Nuevo. En Tipo de operación, seleccione la función Relación de aspecto y, en Máscara, seleccione Componente(1, Area, POLY, Descending). Haga clic en Establecer nombre predeterminado y, a continuación, en Aceptar. Cree la función Mono Circularity. Con la ventana administrador de entidades todavía abierta, haga clic en Nuevo. En Tipo de operación, seleccione la función Circularidad y, en Máscara, seleccione Componente(1, Area, POLY, Descending). Haga clic en Establecer nombre predeterminado y, a continuación, haga clic en Aceptar y, a continuación, en Cerrar para calcular los valores de entidad. Para la gráfica de puntos de celdas MONO circulares, haga clic en el icono Trazado de puntos. Seleccione 1N como la población primaria. Para la operación Eje X, elija Circularity_Component(1, Area, POLY, Descending) y, para la operación Eje Y, elija Aspect Ratio_Component(1, Area, POLY, Descending). Haga clic en Aceptar. Haga clic en el botón Región cuadrada y dibuje una región alrededor de la población de celdas hacia la parte superior derecha del trazado. Asigne a esta región el nombre Circular_1N. Haga clic con el botón derecho en el trazado y haga clic en Regiones. Resalte la región Circular_1N. Cambie las coordenadas X a 20 y 55 y cambie las coordenadas Y a 0,85 y 1,0. Haga clic en Cerrar. Cree la operación POLI/Area_M07 de área. Haga clic en la ficha Análisis y, a continuación, en Característicasy, a continuación, en Nuevo. En Tipo de operación, seleccione la operación Area y, en Máscara, seleccione Componente(1, Area, POLY, Descending). Haga clic en Establecer nombre predeterminado y, a continuación, en Aceptar. Con la ventana administrador de características todavía abierta, haga clic en Nuevo y, a continuación, en Tipo de característica, haga clic en el botón de opción Combinado. En la lista de entidades, resalte Area_Component(1, Area, POLY, Descending) y haga clic en la flecha hacia abajo para agregarlo a la definición de entidad. Haga clic en el símbolo de división (/). Seleccione la función Area_M07 y haga clic en la flecha hacia abajo para agregarla a la definición de entidad. Haga clic en Establecer nombre predeterminado y haga clic en Aceptar. Haga clic en Cerrar para empezar a calcular los valores de entidad. Para la gráfica de puntos de población MONO final, haga clic en el icono de trazado de puntos. Seleccione Circular_1N como la población primaria. Para la operación Eje X, elija Relación de aspecto_M07 y, para la operación Eje Y, elija Area_Component(1, Area, POLY, Descending) / Area_M07. Haga clic en Aceptar. Haga clic en el botón Región cuadrada y dibuje una región alrededor de la mayoría de las celdas. Nombre esta región Mononucleated. Haga clic con el botón derecho en el trazado y haga clic en Regiones. Resalte la región Mononucleada. Cambie las coordenadas X a 0.85 y 1.0 y cambie las coordenadas Y a 0.55 y 1.0. Haga clic en Cerrar.NOTA: Consulte la sección 11 del Suplemento 1 – Protocolo completo para crear las máscaras, características y parcelas para identificar las poblaciones trinucleadas y polinucleadas finales. 12. Cree una vista personalizada para examinar las máscaras BNC y MN Haga clic en el botón Propiedades de la Galería de imágenes y, a continuación, haga clic en la pestaña Ver. En Tipo de nombre Ch01/Ch07. Haga clic en Agregar imagen. En Imagen, elija Ch01 y establezca el Porcentaje en 100. Haga clic en Agregar imagen de nuevo, en Imagen, elija Ch07 y establezca el Porcentaje en 100. Haga clic en Nuevo y en Tipo de nombre Máscaras BNC y MN Haga clic en Agregar columna. En Tipo de imagen, elija Ch01 y, en Máscara, elija Ninguno Haga clic en Agregar columna. En Tipo de imagen, elija Ch07 y, en Máscara, elija Ninguno Haga clic en Agregar columna. En Tipo de imagen, elija Ch07 y, en Máscara, elija BNC Haga clic en Agregar columna. En Tipo de imagen, elija Ch07 y, en Máscara, elija Máscara MN Haga clic en Agregar columna. En Tipo de imagen, haga clic en el botón de opción Compuesto. La imagen compuesta Ch01/Ch07 debe añadirse automáticamente a la vista. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana Propiedades de la Galería de imágenes. 13. Cree una vista personalizada para examinar la máscara POLY Consulte la sección 13 del Suplemento 1 – Protocolo completo para crear una vista personalizada para examinar la máscara POLY 14. Crear una tabla de estadísticas para enumerar los eventos clave Haga clic en la pestaña Informes y, a continuación, haga clic en Definir informe de estadísticas. En la nueva ventana, haga clic en Agregar columnas. Agregue la estadística del conteo BNC. En Estadísticas, seleccione Recuento y, en Población seleccionada, elija la población de BNCs. Haga clic en Agregar estadísticas para agregar la estadística a la lista. Repita el paso 14.2 para crear columnas separadas para las poblaciones MN BN,MONO, TRI y POLY. Haga clic en Cerrar y, a continuación, en Aceptar. La plantilla de análisis de datos está completa (Figura 2). Guarde la plantilla (Archivo, Guardar como plantilla). La lista completa de máscaras se puede encontrar en Suplemento 2 – Listade máscaras . 15. Archivos de experimentos de procesos por lotes utilizando la plantilla de análisis de datos En el menú Herramientas, haga clic en Archivos de datos por lotes y, a continuación, haga clic en Agregar lote en la nueva ventana. En la nueva ventana, haga clic en Agregar archivos para seleccionar los archivos de experimento (.rif) que desea agregar al lote. En la opción Seleccionar una plantilla o un archivo de análisis de datos (.ast, .daf), haga clic en el icono de carpeta abierta para buscar y abrir la plantilla de análisis de datos (archivo .ast) que se guardó en el paso 14.4. Haga clic en el botón Vista previa del informe de estadísticas para obtener una vista previa de la tabla de estadísticas. No se mostrarán valores aquí, ya que aún no se han calculado. Sin embargo, este paso sirve como comprobación para asegurarse de que se ha seleccionado la plantilla de análisis adecuada antes de ejecutar el lote. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana actual. A continuación, haga clic en Enviar lotes para iniciar el procesamiento por lotes de todos los archivos. Cuando se haya completado el procesamiento por lotes, un archivo .txt estará disponible en la carpeta que contiene todos los archivos .rif. Utilice estas estadísticas para calcular la genotoxicidad y la citotoxicidad. 16. Cálculo de los parámetros de genotoxicidad y citotoxicidad Cálculo de la genotoxicidad: Para calcular la genotoxicidad, utilice la tabla estadística creada en 15.5. Divida el número de células en la población de BN BN por el número de células en la población de BNCs y luego multiplique por 100: Cálculo de la citotoxicidad: Determine el número total de células POLY sumando el número de células TRI y QUAD. Calcule el índice de proliferación de bloques de citoquinesis (CBPI) utilizando el número de celdas en MONO, BNCs y POLY de la siguiente manera: Por último, calcule la citotoxicidad de cada cultivo utilizando los valores CBPI de los cultivos de control (C) y el cultivo expuesto químicamente (T) de la siguiente manera:

Representative Results

El método de análisis descrito en este documento permite la identificación automática y la puntuación de las BNC, con y sin MN, para calcular la genotoxicidad. Además, las células MONO y POLY también se identifican y puntúan automáticamente para calcular la citotoxicidad. Los criterios de puntuación publicados6,34 que deben cumplirse al puntuar estos eventos se implementan en el software de análisis de datos MIFC. Los resultados presentados aquí indican que se pueden detectar aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia de mn con citotoxicidad creciente tras la exposición de células TK6 linfooblastoide humanas a sustancias químicas inductoras de MN bien conocidas (Mitomicina C y Colchicina). En una publicación separada32se han demostrado resultados similares para productos químicos adicionales analizados. Además, los resultados del uso de Mannitol muestran que los productos químicos no inducidos por MN también se pueden identificar correctamente utilizando el método MIFC descrito aquí. Los parámetros descritos en el protocolo para crear todas las máscaras, entidades y límites de región probablemente tendrán que ajustarse si se utilizan diferentes tipos de celdas (por ejemplo, celdas de hámster chino) para realizar el ensayo. La Figura 3 muestra cuatro paneles seleccionados para identificar los BNC (Figura3A-3D). Aquí se muestra un histograma que permite la selección de celdas con dos núcleos (Figura3A)y gráficas bivariadas que permiten la selección de BNCs con una circularidad similar (Figura3B), áreas e intensidades similares (Figura3C ) y las BNC que tengan núcleos bien separados y no superpuestos (figura3D) según la critieria de puntuación6,34. Figura 3 E muestra las imágenes BF y Hoechst, así como las máscaras BNC y MN que indican que los BNC con un MN simple o múltiple pueden ser identificados y enumerados. Esto permite calcular la genotoxicidad determinando la tasa de BNC micronucleadas en la población final de BNC. La Figura 4 muestra la aplicación de la función Recuento de puntos utilizando la máscara POLY para identificar las celdas MONO, TRI y QUAD. El número de celdas TRI y QUAD se puede sumar para obtener el número final de celdas POLY (Tabla 1). Esto permite que la citotoxicidad se calcule utilizando la fórmula que se muestra en el protocolo. Por lo tanto, cada punto de dosis en el experimento puede ser evaluado por parámetros de genotoxicidad y citotoxicidad. La Figura 5 muestra los valores de genotoxicidad y citotoxicidad para la colchicina de aneugénica, el clastogen Mitomicina C y para un control negativo, Mannitol. Para La colchicina (Figura5A) las dosis de 0,02 a 0,05 g/ml produjeron aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia MN, que oscilaban entre el 1,28% y el 2,44%, respectivamente, sobre el control del disolvente (Tabla1). En el caso de la mitomicina C (Figura5B), las dos dosis superiores de 0,4 y 0,5 g/ml produjeron frecuencias MN estadísticamente significativas en comparación con los controles de disolvente. Estas frecuencias MN fueron del 0,93% a 0,4 g/ml y del 1,02% a 0,5 g/ml (Tabla2). Por último, para Mannitol (Figura5C),ninguna dosis probada induce una citotoxicidad superior al 30%, ni produjeron aumentos significativos en la frecuencia De MN en comparación con los controles de disolvente, como se esperaba (Tabla3). Figura 1 : Ajustes del instrumento MIFC. Una captura de pantalla de la configuración MIFC como se describe en el paso de sección 7 del protocolo. (A) Ajuste de la potencia láser de 405 nm a 10 mW. (B) Ajuste de los canales BF 1 y 9. (C) Selección de la lente objetivo de aumento de 60x. (D) Selección de la velocidad de flujo más lenta que genera imágenes con la resolución más alta. (E) Especificar el número de eventos que se recopilarán en 20.000. (F) Haga clic en el botón Cargar para iniciar el proceso de carga de muestra. (G) Haga clic en el botón Adquirir para comenzar a adquirir imágenes. (H) Haga clic en el botón Retorno para devolver cualquier muestra no utilizada. (I) Gráfico de dispersión de la relación de aspecto BF frente al área BF para la selección de celdas individuales. (J) Diagrama de dispersión de Degradado Hoechst RMS frente a Degradado BF RMS para la selección de celdas enfocadas. (K) Histograma de intensidad Hoechst para la selección de células positivas de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Estrategia de análisis de software. Una captura de pantalla de la estrategia de gating descrita en la sección 9 del protocolo. Las regiones se muestran en orden secuencial para la identificación de células binucleadas (caja roja), micronúcleos (caja amarilla) y células monoyucleadas y polinucleadas (caja azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Identificación y puntuación de BNCs con y sin MN. (A) Selección de células que tienen dos núcleos distintos. (B) Identificación de células binucleadas (BCN) que tienen dos núcleos altamente circulares mediante el uso de la función Intensidad de relación de aspecto. (C) Selección de BNCs que tienen núcleos con áreas e intensidades similares. Esto se logra calculando la relación entre el área de ambos núcleos como la relación de aspecto de ambos núcleos. (D) Uso de las características Relación de forma y Relación de aspecto para identificar los BNC que tienen dos núcleos bien separados. (E) La función de recuento de manchas mediante la máscara de micronúcleo (MN) que demuestra que se pueden identificar y enumerar bNC con un mN único o múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : Identificación y puntuación de células MONO y POLY. Uso de la función de recuento de puntos para identificar y enumerar celdas mono, triculas y cuadránucleadas. La máscara de componente 1 permite la identificación de celdas mononucleadas (imagen superior). Las máscaras de componentes del 1 al 3 permiten la identificación de celdas trinucleadas (imagen media). Las máscaras de componentes del 1 al 4 permiten la identificación de celdas cuadranucleadas (imagen inferior). Esta cifra ha sido modificada de Rodrigues 201832. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : Cuantificación de la citotoxicidad. Citotoxicidad cuantificada utilizando el índice de proliferación de bloques de citoquinesis (círculos negros) y genotoxicidad cuantificada utilizando el porcentaje de MN (barras claras) tras una exposición de 3 h y una recuperación de 24 h para (A) Colchicina, (B) Mitomicina C y ( C) Mannitol. Los aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia MN en comparación con los controles son indicados por las estrellas (prueba chi-cuadrada; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). Todas las cantidades son el promedio de dos réplicas en cada punto de dosis. Esta cifra ha sido modificada de Rodrigues 201832. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1: Los parámetros necesarios para calcular la citotoxicidad (el número de células mononucleadas, biypolinucleadas) y la genotoxicidad (el número y porcentaje de células binucleadas micronucleadas) para Colchicina. Todas las cantidades calculadas son el promedio de dos réplicas en cada punto de dosis. Cuadro 2: Losparámetros necesarios para calcular la citotoxicidad (el número de células mononucleadas, biynucleadas) y la genotoxicidad (el número y porcentaje de células binucleadas micronucleadas) para la mitomicina C. Todas las cantidades calculadas son el promedio de dos réplicas en cada punto de dosis. Cuadro 3: Los parámetros necesarios para calcular la citotoxicidad (el número de células mononucleadas, biypolinucleadas) y la genotoxicidad (el número y porcentaje de células binucleadas micronucleadas) para Mannitol. Todas las cantidades calculadas son el promedio de dos réplicas en cada punto de dosis. Suplemento 1: Protocolo completo. Haga clic aquí para descargar este archivo. Suplemento 2: Lista de máscaras. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

En una publicación reciente, Verma et al. subrayaron la importancia de desarrollar un sistema que combine la ventaja de alto rendimiento de la citometría de flujo con los beneficios de datos y almacenamiento de imágenes del análisis de imágenes35. El ensayo IN vitro mN del MIFC descrito en este documento satisface esta cita y tiene el potencial de superar muchos de los desafíos antes mencionados en los métodos de microscopía y citometría de flujo. El protocolo descrito aquí demuestra que tanto la citotoxicidad como la genotoxicidad pueden evaluarse utilizando MIFC. La preparación de muestras, la tinción celular y la recopilación de datos son sencillas, pero hay algunos pasos críticos en el protocolo que siempre deben implementarse. La adición de cloruro de potasio (KCl) a las células es fundamental para hinchar las células, generando separación entre los núcleos principales. Esto garantiza que el algoritmo de enmascaramiento pueda identificar todos los núcleos individuales en las celdas BNIC y POLY (células POLY) que son necesarias para su enumeración. Además, La KCL proporciona separación entre núcleos y MN, lo que es esencial para el enmascaramiento y la cuantificación precisos de MN. Además, el uso de formalina después de la adición de KCl evita que las células lisien durante la centrifugación. La adición de cytochalasina B hace que las células TK6 que han sufrido más de una división nuclear sean bastante grandes. Como resultado, el citoplasma se vuelve frágil y puede aplicar seis si la centrifugación se realiza inmediatamente después de la adición de KCl. Además, es muy importante introducir Hoechst en la muestra según el número de células de la muestra y no según una concentración final. Por ejemplo, una concentración final de 10 g/ml de Hoechst manchará uniformemente una muestra de 1 x 106 células, pero puede no manchar adecuadamente una muestra que contenga 5 x 106 células y puede dar lugar a muchas células con núcleos tenuemente manchados, lo que dificulta el análisis. También es importante tener en cuenta que Hoechst puede ser reemplazado por otro tinte de ADN como DAPI si el MIFC está equipado con el láser de excitación de 405 nm o DRAQ5 si el MIFC está equipado con el láser de excitación de 488 nm y/o 642 nm. Si se modifica la mancha nuclear, es fundamental valorar la mancha para encontrar la concentración adecuada para la potencia láser requerida/deseada.

Al recopilar datos en el MIFC, es importante determinar los límites de región óptimos para las entidades de Gradient RMS. Los límites presentados en este protocolo pueden requerir un ajuste debido a algunas ligeras variaciones entre los instrumentos MIFC. La aplicación de esta característica durante la recopilación de datos es esencial para garantizar que se capturen imágenes altamente enfocadas. Si los archivos de datos contienen muchas imágenes borrosas o desenfocadas, es probable que los algoritmos de enmascaramiento en el software de análisis resalten incorrectamente los artefactos de tinción en las áreas borrosas, lo que conduce a un alto número de artefactos falsos positivos que se puntúan como MN. Aunque las técnicas de procesamiento de imágenes descritas aquí pueden ser difíciles, una vez que se ha desarrollado una plantilla de análisis en el software MIFC, el procesamiento por lotes permite analizar automáticamente los archivos de datos, eliminando la intervención del usuario y, por lo tanto, el marcador predisposición. Además, si se utiliza una línea de celda distinta de las celdas TK6 para realizar el ensayo, será necesario modificar las máscaras y los límites de región, ya que las propiedades morfológicas (por ejemplo, el tamaño) de las celdas diferirán de las de las celdas TK6.

Los resultados presentadosaquí (Figura 5) muestran aumentos estadísticamente significativos en la inducción de MN al exponer las células TK6 a varias dosis de Mitomicina C y Colchicina. Se observaron aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia de MN en comparación con los controles de disolventes para varias dosis en ambos productos químicos. Además, ninguna dosis de Mannitol indujo una citotoxicidad por encima del 30%, ni un aumento estadísticamente significativo en la frecuencia de MN en comparación con los controles de disolvente, como se esperaba. El protocolo descrito en este documento utilizando MIFC para realizar el ensayo in vitro de MN da los resultados esperados de productos químicos de control positivos y negativos. Es muy importante realizar una serie de experimentos utilizando controles de disolvente y productos químicos de control negativo para desarrollar valores basales tanto de la frecuencia de MN como del índice de proliferación de bloques de citoquinesis (CBPI). En el caso de la genotoxicidad, los aumentos estadísticamente significativos de la frecuencia MN se determinan mediante la comparación con las frecuencias DeN basales que deben ser bien conocidas por el tipo de célula que se utiliza. Además, todos los cálculos de citotoxicidad se basan en el CBPI de las muestras de control y, por lo tanto, las tasas de referencia de las células MONO, BNC y POLY deben cuantificarse bien en los controles.

En los trabajos anteriores29,32,se han descrito varias limitaciones y ventajas de utilizar MIFC en el contexto del ensayo MN. Las principales limitaciones se refieren a frecuencias MN más bajas en comparación con la microscopía, que probablemente resulta tanto de la falta de flexibilidad al implementar los criterios de puntuación en el software de análisis, así como de la limitada profundidad de campo del MIFC. Las máscaras bien contorneadas se pueden crear para identificar con precisión los núcleos principales, pero mN que están tocando (o muy cerca) los núcleos principales podrían ser capturados dentro de la máscara BNC. Además, muy pequeño MN que se puede puntuar bastante fácilmente usando microscopía probablemente se pierda incorrectamente cuando se utiliza MIFC debido al límite inferior en el parámetro de área de la máscara MN para evitar la puntuación de artefactos pequeños. Además de las dificultades presentes en el análisis de datos basado en imágenes, debido a su diseño, MIFC obtiene imágenes de proyección bidimensional de objetos celulares tridimensionales. Esto probablemente hace que algunos MN sean capturados a una profundidad de enfoque diferente que los dos MN principales, haciéndolos parecer muy tenues e ircorables usando enmascaramiento. Además, una pequeña fracción de MN podría residir detrás de uno de los dos núcleos principales, por lo que es imposible visualizarlos y puntuarlos. Por lo tanto, teniendo en cuenta estas dificultades, se debe tener precaución al interpretar aumentos significativos en la frecuencia MN a dosis bajas.

A pesar de estas deficiencias, el método MIFC descrito aquí ofrece varias ventajas sobre otras técnicas. Fenech y otros propusieron criterios y directrices que deben tenerse en cuenta al desarrollar sistemas y metodologías automatizados para los ensayos de MN36. Estos incluyen, pero no se limitan a, la visualización directa de los núcleos principales y el citoplasma, la determinación de la frecuencia de MN a partir de diversas dosis del producto químico o agente que se está probando y la capacidad de cuantificar la morfología y determinar la posición de todos núcleos y MN para asegurarse de que están dentro del citoplasma. Este documento muestra que el método MIFC desarrollado para realizar el ensayo in vitro de MN satisface (o posee el potencial de satisfacer) estos criterios. Específicamente, las imágenes de los núcleos y MN pueden ser capturadas por los láseres fluorescentes, mientras que las imágenes citoplasmáticas se pueden obtener mediante el uso del LED BF. Las imágenes de células con morfología nuclear normal se pueden diferenciar automáticamente de aquellas células con morfología irregular utilizando una combinación de máscaras y características avanzadas. Los resultados presentados para Colchicina y Mitomicina C (Figura5) muestran que tanto la genotoxicidad como la citotoxicidad pueden evaluarse a diversas dosis en comparación con los controles de disolventes y que se observan frecuencias MN estadísticamente significativas cuando se observan frecuencias MN estadísticamente significativas Esperado. Además, la Orientación 487 de la OCDE recomienda puntuar 2.000 BNC por concentración de ensayo para evaluar la presencia deMN para determinar la genotoxicidad junto con al menos 500 células por concentración de ensayo para determinar la citotoxicidad 9; esto puede tomar más de 1 h usando microscopía manual. El protocolo y los resultados de este documento muestran que un promedio de aproximadamente 6.000 BNCs, 16.000 células MONO y 800 células POLY fueron capturados y puntuados por concentración de prueba en aproximadamente 20 minutos. La rápida tasa de adquisición de datos y el alto número de células candidatas puntuadas en tan poco tiempo ponen de relieve otra ventaja importante de emplear miFC para realizar el ensayo in vitro de MN.

Si bien los resultados presentados en este documento son alentadores, son representativos de un método de prueba de concepto temprano. Este trabajo debe ser seguido por una investigación más exhaustiva de un conjunto químico más grande y diverso que cubre múltiples clases y mecanismos de genotoxicidad y citotoxicidad como los sugeridos por Kirkland et al.37 Realización de tales estudios son tiempo y mucho trabajo, y quedan fuera del alcance de este documento, sin embargo, estos estudios a mayor escala proporcionarán información valiosa sobre la capacidad del método para identificar de manera confiable agentes débilmente genotóxicos. La metodología presentada aquí aún no se ha miniaturizado a un formato de micropozo, lo que permitiría un cribado más rápido y eficiente en un rango de dosis más grande. Como tal, en su forma actual, el ensayo in vitro MN basado en MIFC presentado aquí puede ser el más adecuado para estudios de seguimiento intensivos en mano de obra o investigación sobre buenas prácticas de laboratorio. Sin embargo, el método seguirá siendo optimizado y validado, y posee el potencial de permitir una mayor flexibilidad en la detección de eventos químicos específicos relacionados con la morfología, como la exposición a neugeno que aumenta la proporción de células con núcleos no circulares que todavía son escorables38. Por último, el método MIFC presenta una oportunidad para introducir biomarcadores adicionales en el ensayo MN (por ejemplo, tinción de kinetochore) para proporcionar una visión más completa del mecanismo de inducción de MN.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La autora agradece a Christine Probst (Luminex Corporation) sus esfuerzos en el desarrollo de formas anteriores de la plantilla de análisis de datos, así como la Dra. Haley Pugsley (Luminex Corporation) y el Dr. Phil Morrissey (Luminex Corporation) por revisar y editar la Manuscrito.

Materials

15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser – Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler – 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC – ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software – IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software – INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse – Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath – PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent – SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).
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