Summary

산화 스트레스는 Mitis 그룹 Streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부

Published: March 23, 2019
doi:

Summary

선 충 류 꼬마 선 충 호스트 병원 체 상호 작용을 해 부에 우수한 모델입니다. 여기에 설명 된 멤버 mitis 그룹 streptococci와 웜 감염 유 기체의이 그룹에 의해 생산 H2O2 에 대 한 산화 스트레스 반응의 활성화를 결정 하는 프로토콜이입니다.

Abstract

꼬마 선 충 (C. 선 충), 살아있는 선 충 류, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하는 매력적인 모델로 떠오르고 있다. 제시 프로토콜이이 모델을 사용 하 여 H2O2의 생산을 통해 mitis 그룹 streptococci 기인한 pathogenicity 결정. Mitis 그룹 streptococci bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 봉와 직 염 등 많은 인간의 질병을 일으키는 원인이 되는 신흥 위협입니다. 여기에 설명 된 H2O2 에 대 한 응답에이 벌레의 생존을 결정 하는 프로토콜에 의해 생산 병원 체의이 그룹. 산화 긴장 응답 녹음 방송 요인에 대 한 유전자 skn-1 인코딩을 사용 하 여,이 모델은 연쇄 구 균 감염에 대 한 필수적인 호스트 유전자를 식별 하는 데 중요 한 표시 됩니다. 또한, 유전자 변형 기자 웜 변형, SKN-1 녹색 형광 단백질 (GFP)를 융합은 사용 하 여이 병원 균의 존재 산화 스트레스 반응의 활성화를 모니터링할 수 있습니다 표시 됩니다. 이 분석 실험 것 반대로 생물 소스에 의해 파생 된 H2O2 로 산화 스트레스 반응을 기회 반응성 산소 종 (선생님) 소스를 추가 제공 합니다.

Introduction

Mitis 그룹 streptococci oropharyngeal 구멍1의 인간의 공생입니다. 그러나, 이러한 생물이이 틈새를 탈출 하 고 침략 적인 질병2의 다양 한을 발생할 수 있습니다. 이러한 미생물에의 한 감염 등 bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 cellulitis2,,34,,56. 또한, 그들은 혈 류 감염의 원인으로 대리인은 신흥 시내 immunocompromised, neutropenic, 그리고 화학 요법5,,78,9 받은 암 환자 .

몇 가지 독성 요인 확인 되었습니다 있기 때문에 기본 mitis 그룹 병 인은 애매 한 메커니즘. Mitis 그룹은 H2O2, 구강 미생물 커뮤니티10에서 중요 한 역할을 보여줘 생산으로 알려져 있다. 최근 여러 연구 cytotoxin 상피 세포 죽음11,12-유도로 H2O2 에 대 한 역할을 강조 했습니다. S. 폐 렴, 이 그룹에 속하는 DNA 손상 및13치경 세포 있는 apoptosis를 유도 하는 H2O2 의 높은 수준의 생산을 보였다. 급성 폐 렴 동물 모델을 사용 하 여, 동일한 연구원은 박테리아에 의해 H2O2 의 생산 독성 우위를 수 여 한다 설명 했다. 폐 렴 균 성 수 막 염에 대 한 연구 또한 그 병원 체 파생 된 H2O2 를 신경 세포 죽음14트리거 pneumolysin와 synergistically 역할 표시. 이 관측은 명확 하 게 박테리아의이 그룹에 의해 생산을 H2O2 는 그들의 pathogenicity에 대 한 중요 한 설정 합니다.

흥미롭게도, 그것은 또한 보였다는 mitis의 회원 그룹 S. mitis 및 H2O215,16의 생산을 통해 선 충 C. 선 충 의 죽음의 원인이 S. oralis . 이 살아있는 선 충 류는 많은 생물 학적 과정을 공부 하 간단 하 고, 유전으로 온순한 모형으로 사용 되었습니다. 더 최근에, 웜은 호스트 병원 체 상호 작용17,18연구 모델로 떠오르고 있다. 또한, 여러 연구 공부 하는이 유기 체19,20,21을 사용 하 여 산화 스트레스의 중요성을 강조 했습니다. 그것의 짧은 라이프 사이클, RNAi에 의해 관심의 최저의 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP)의 사용-융합된 기자 유전자 발현을 모니터링 하는 특성을 그것에 게 매력적인 모델 시스템의 일부. 더 중요 한 것은, 산화 스트레스와 벌레에 타고 난 면역 조절 경로 높은 포유류20,22보존 됩니다.

이 프로토콜에서 그것는 연쇄 구 균 파생 된 H2O2로 인 한 pathogenicity 명료 하 C. 선 충 을 사용 하는 방법은 보여 줍니다. 수정 된 생존 분석 결과 표시 하 고 mitis 그룹의 구성원을 급속 하 게 벌레를 죽 일 수 있습니다 통해 H2O2의 생산. 반응 산소 종의 지속적인된 생물 소스 mitis 그룹의 구성원을 사용 하 여 (선생님) 제공, 벌레에 산화 스트레스를 유발 하는 화학 원본에 반대 합니다. 또한, 박테리아는 H2O2 (여러 방 벽을 교차 하 고 있는 다른 소스에 비해) 창 자 세포에 직접 타겟이 될 수 있는 벌레를 빠르게, 식민지 수 있습니다. 분석 결과 중 1)으로 skn-1 돌연변이 스트레인의 또는 2) skn-1 웜 N2 야생-타입 기준 및 벡터 제어 처리 벌레에 RNAi를 사용 하 여 아래로 노크 하 여 생존을 결정 하는 유효성이 검사 됩니다. SKN-1 C. 선 충23,,2425의 산화 스트레스 반응을 조절 하는 중요 한 전사 요소입니다. 생존 분석, 뿐만 아니라 SKN-1B/C::GFP 유전자 변형 기자 표현 웜 변형 mitis 그룹은 산화 긴장 응답을 통해 H2O2 의 생산의 활성화를 모니터링 하는 데 사용 됩니다.

Protocol

1. 네 (토 드-휴이 트 효 모 추출 물) 한 천 배지 준비 미디어의 1 L, 토 드-휴이 트 분말, 효 모 추출 물 및 2 L 삼각 플라스 크를 한 20 g 2 세대의 30 g 추가. 이온된 수의 970 mL 플라스 크의 내용에 추가 하 고 볶음 바 포함. 압력솥에서 121 ° C의 온도 압력 30 분 동안 15 파운드/인치2 의 미디어. 그 후, 저 어 접시에 미디어를 설정 하 고 부드러운 감동으로 냉각 허용. 층 류 흐름에서 ?…

Representative Results

mitis의 회원 그룹 S. mitis, S. oralis, S. gordonii 빠르게 사망 S. mutans, S. salivarius, 및 비 병원 성 대장균 에 반대 벌레, OP50 (그림 3A). S. mitis, S. oralis, S. gordonii 메디아 생존이 이었다 300 분, 300 분, 345 분, 각각. 살인 H2O2에 의해 중재 된 경우를 확인 하려면 catalase 네 agar에…

Discussion

Enterococcus faecium, H2O2 에서 혐 기성 성장 생산 등 다른 병원 성 세균에 대 한 설명 하는 메서드를 사용할 수 있습니다 microaerophilic26조건 또는. 일반적으로, 대부분 병원 성 유기 체를 위한 그것은 걸립니다 몇 일 주 생존 분석 실험. 그러나, mitis 그룹의 구성원에 의해 H2O2 의 강력한 생산으로 인해 이러한 분석 5-6 h 설명 된 조건 내에서 완료 될 …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 감사 박사 빙 연의 왕, 박사 장군이 Tribble (텍사스 대학, 치과의 학교), 박사 리처드 Lamont (루이스 빌 대학, 치과의 학교), 및 실험실 및 임상 긴장의 제공에 대 한 박사 사무엘 셸 번 (MD 앤더슨 암 센터) mitis streptococci 그룹. 우리는 또한 선 충 C. 긴장에 대 한 박사 키이 스 블랙 웰 (유전학의 부, 하버드의과 대학) 감사합니다. 마지막으로, 우리 감사 박사 다니엘 Garsin와 그녀의 실험실 (텍사스 대학, 맥 거 번의과 대학) 시 약 및 연구 수행을 웜 변종. 일부 웜 변종 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다.

Materials

Media and chemicals
Agarose  Sigma Aldrich A9539-50G
Bacto peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Broth Fisher Scientific DF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated   Fisher Scientific B11947
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood) Fisher Scientific R01200
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Carbenicillin Fisher Scientific BP26481
Catalase  Sigma Aldrich C1345-1G
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
IPTG Fisher Scientific MP21021012
Magnesium sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-500
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
Tetracyclin Sigma Aldrich 87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochloride Sigma Aldrich L9756
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) Fisher Scientific 08-757-100A
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis  
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
N2 C. elegans wild isolate CGC
EU1 skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) CGC
LD002 IdIs1 SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) Keith Blackwell

References

  1. Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  2. Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
  3. Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
  4. Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
  5. Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
  6. van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
  7. Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
  8. Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
  9. Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
  10. Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
  11. Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
  12. Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
  13. Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
  14. Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
  15. Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
  16. Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
  17. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned–microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
  18. Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
  19. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
  20. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  21. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, 290-301 (2015).
  22. Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
  23. Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
  24. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  25. An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
  26. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  27. Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
  28. Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).

Play Video

Citer Cet Article
Naji, A., Al Hatem, A., van der Hoeven, R. Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59301, doi:10.3791/59301 (2019).

View Video