Étudier le Stress oxydatif causé par les streptocoques de groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans
Summary
Le nématode Caenorhabditis elegans est un excellent modèle pour disséquer les interactions hôte-pathogène. Décrit ici est un protocole visant à infecter le ver avec des membres des mitis streptocoques et déterminer l’activation de la réponse au stress oxydatif contre H2O2 produites par ce groupe d’organismes.
Abstract
Caenorhabditis elegans (c. elegans), un nématode libre, est devenue un modèle attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Le protocole présenté utilise ce modèle pour déterminer le caractère pathogène causé par le streptocoque du groupe mitis via la production de H2O2. Les streptocoques de groupe mitis sont une menace émergente qui provoquent de nombreuses maladies humaines telles que bactériémie, endocardite et orbitaire. Décrit ici est un protocole pour déterminer la survie de ces vers en réponse à H2O2 produit par ce groupe d’agents pathogènes. Utilisant le skn-1 gène codant pour un facteur de transcription de réponse de stress oxydatif, on montre que ce modèle est important pour l’identification des gènes hôtes essentiels contre une infection à streptocoque. En outre, il est démontré que l’activation de la réponse au stress oxydatif peut être surveillée en présence de ces agents pathogènes en utilisant une souche de ver journaliste transgéniques, dans lequel SKN-1 est fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP). Ces tests fournissent l’occasion d’étudier la réponse au stress oxydatif H2O2 résultant d’une source biologique par opposition à un exogène ajouté réactives de l’oxygène (dro) sources.
Introduction
Streptocoques du groupe Mitis sont commensaux humaine de la cavité oropharyngée1. Toutefois, ces organismes peuvent échapper à ce créneau et causer une variété de maladies invasives2. Les infections provoquées par ces micro-organismes incluent une bactériémie, endocardite et orbitaire2,3,4,5,6. En outre, ils font leur apparition des agents comme responsables de bactériémies à neutropéniques immunodéprimés et cancéreux qui ont subi une chimiothérapie5,7,8,9 .
Les mécanismes sous-jacents pathogenèse de groupe mitis est obscur, parce que quelques-uns des facteurs de virulence ont été identifiés. Le groupe de la mitis est connu pour produire H2O2, qui a montré à jouer un rôle important dans les communautés microbiennes orale10. Plus récemment, plusieurs études ont mis en évidence un rôle pour H2O2 comme une cytotoxine qui induit des cellules épithéliales mort11,12. Pneumonie de S., qui appartient à ce groupe, a été démontré pour produire des niveaux élevés de H2O2 qui induit des lésions de l’ADN et l’apoptose dans les cellules alvéolaires13. À l’aide d’un modèle animal de pneumonie aiguë, les mêmes chercheurs ont démontré que la production de H2O2 par les bactéries confère un avantage de virulence. Études sur la méningite à pneumocoques ont également montré que dérivé de pathogène H2O2 agit en synergie avec pneumolysin pour déclencher des cellules neuronales mort14. Ces observations établissent clairement que l’H2O2 produites par ce groupe de bactéries est important pour leur pouvoir pathogène.
Fait intéressant, il a également été démontré que les membres de la mitis du groupe S. mitis et s. oralis entraînent la mort de la nématode c. elegans , via la production de H2O215,16. Ce nématode libre a été utilisé comme un modèle simple, génétiquement tractable pour étudier de nombreux processus biologiques. Plus récemment, le ver est devenue un modèle pour l’étude de17,des interactions hôte-pathogène18. En outre, plusieurs études ont souligné l’importance d’étudier le stress oxydatif, à l’aide de cet organisme19,20,21. Son cycle de vie court, la capacité de knockdown gènes présentant un intérêt par Arni et l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP)-fusible reporters pour contrôler l’expression des gènes sont quelques-uns des attributs qui en font un système modèle attrayant. Plus important encore, les voies qui régulent le stress oxydatif et l’immunité innée dans la vis sans fin sont hautement conservées avec mammifères20,22.
Dans le présent protocole, on démontre comment utiliser le c. elegans pour élucider le pouvoir pathogène causé par le streptocoque dérivés H2O2. Un test de survie mis à jour l’apparaît, tandis que les membres du groupe mitis sont capables de tuer les vers rapidement via la production de H2O2. À l’aide des membres du groupe mitis, une source biologique durable des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est fourni, par opposition aux sources chimiques qui provoquent le stress oxydatif dans les vers. En outre, les bactéries sont capables de coloniser les vers rapidement, ce qui permet pour H2O2 à cibler directement les cellules intestinales (par rapport à d’autres sources qui ont à franchir plusieurs obstacles). L’essai est validé soit 1) par détermination de la survie de la souche mutante skn-1 ou 2) en abattant de skn-1 à l’aide d’Arni en vers par rapport à la N2 sauvage et vector control traité vers. SKN-1 est un facteur de transcription importante qui régule la réponse de stress oxydatif chez c. elegans23,24,25. En plus des essais de survie, une souche ver exprimant un journaliste transgénique SKN-1 b/C::GFP est utilisée pour contrôler l’activation de la stress oxydatif réponse via la production de H2O2 par le groupe de la mitis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites peuvent être utilisés pour d’autres bactéries pathogènes telles que Enterococcus faecium, qui produit aussi H2O2 cultivés en anaérobie ou26des conditions microaérophiles. En général, pour les plus pathogènes, il faut plusieurs jours à semaines pour réaliser les essais de survie. Toutefois, en raison de la production robuste de H2O2 par les membres du groupe mitis, ces épreuves pourraient être complétées …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions m. Bing-Yan Wang, Dr Gena Tribble (The University of Texas, école de médecine dentaire), Dr. Richard Lamont (Université de Louisville, école de médecine dentaire) et le Dr Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) pour la fourniture de laboratoire et des souches cliniques de Les streptocoques de groupe mitis. Nous remercions également m. Keith Blackwell (département de génétique, Harvard Medical School) pour les souches de c. elegans . Enfin, nous remercions le Dr Danielle Garsin et son laboratoire (The University of Texas, faculté de médecine de McGovern) pour la fourniture de réactifs et souches de ver pour mener l’étude. Certaines souches de ver ont été fournis par la CCG, qui est financée par le NIH bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440).
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
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