At studere Oxidative Stress forårsaget af Mitis gruppe streptokokker i Caenorhabditis elegans

Mitis gruppe streptokokker er menneskelige latente i svælg cavity¹. Men, disse organismer kan undslippe denne niche og forårsage en række invasive sygdomme². Infektioner forårsaget af disse mikroorganismer omfatter bakteriæmi, endocarditis, og orbital cellulitis^2,3,4,5,6. Desuden, de dukker op som agenser af infektioner i blodet i immunkompromitterede, neutropeni, og kræftpatienter, der har undergået kemoterapi^5,7,8,9 .

Mekanismerne underliggende mitis gruppe patogenesen er uklare, fordi få virulens faktorer er blevet identificeret. Gruppen mitis er kendt for at producere H₂O₂, som har vist sig for at spille en vigtig rolle i mundtlig mikrobielle samfund¹⁰. For nylig, flere undersøgelser har fremhævet en rolle for H₂O₂ som en cytotoxin, der inducerer epitelcelle død^11,12. S. lungebetændelse, der tilhører denne gruppe, har vist sig at producere høje niveauer af H₂O₂ der inducerer DNA-skader og apoptose i alveolær celler¹³. Ved hjælp af en akut lungebetændelse dyremodel, vist de samme forskere, at produktionen af H₂O₂ af bakterier giver en virulens fordel. Undersøgelser på pneumokok-meningitis har også vist, at patogenet-afledte H₂O₂ virker synergistisk med pneumolysin til at udløse neuronal celle død¹⁴. Disse observationer fastsætter klart, at H₂O₂ produceret af denne gruppe af bakterier er vigtig for deres sygdomsfremkaldende evne.

Interessant, har det også vist sig at medlemmer af mitis gruppe S. mitis og S. oralis medføre døden af den ødelægge C. elegans via produktion af H₂O₂^15,16. Denne fritlevende nematode har været brugt som en enkel, genetisk tractable model til at studere mange biologiske processer. Mere nylig, ormen er opstået som en model til at studere vært-patogen interaktioner^17,18. Derudover har flere undersøgelser fremhævet vigtigheden af at studere oxidativt stress ved hjælp af denne organisme^19,20,21. Dens korte livscyklus, evne til knockdown gener af interesse af RNAi og brug af grønne fluorescerende proteiner (NGL)-sammensmeltet reportere til overvågning af genekspression er nogle af de attributter, der gør det til en attraktiv modelsystem. Endnu vigtigere, er de veje, der regulerer oxidativ stress og medfødt immunitet i ormen meget bevaret med pattedyr^20,22.

I denne protokol, er det vist hvordan C. elegans til at belyse patogenicitet forårsaget af streptokok-afledte H₂O₂. En modificeret overlevelse assay er vist, og medlemmer af gruppen mitis er i stand til at dræbe ormene hurtigt via produktion af H₂O₂. Ved hjælp af medlemmer af gruppen mitis, en vedvarende biologisk kilde af reaktive ilt arter er (ROS) fastsat, i modsætning til kemiske kilder, der inducerer oxidativt stress i worms. Endvidere, bakterier er at kolonisere orme hurtigt, hvilket gør til H₂O₂ rettes direkte til tarmens celler (sammenlignet med andre kilder, der er nødt til at krydse flere barrierer). Analysen er valideret, enten 1) ved fastsættelsen overlevelse af skn-1 mutant stamme eller 2) ved at banke ned skn-1 ved hjælp af RNAi i orme i forhold til N2 vildtype og vektor kontrol behandles orme. SKN-1 er en vigtige transkriptionsfaktor, der regulerer oxidative stressrespons i C. elegans^23,24,25. Ud over overlevelsen assays bruges en orm stamme at udtrykke en SKN-1B/C::GFP transgene reporter til at overvåge aktivering af oxidative stress respons via produktion af H₂O₂ af gruppen mitis.