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Recherche en cancérologie

En reprise cellule tumorale in Vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes T

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59275
, , , , ,
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center

Summary

Nous décrivons ici une méthode de culture in vitro de co aux cellules de T de tumeur ciblée de défi de manière récursive, qui permet une analyse phénotypique et fonctionnelle de l’activité antitumorale des lymphocytes T.

Abstract

Le domaine de la thérapie de T cell receptor (voiture) antigène chimérique progresse rapidement avec des améliorations dans le design automobile, approches gène-ingénierie et fabrication des optimisations. Un défi pour ces efforts de développement, cependant, a été la mise en place d’essais in vitro pouvant étayer solidement la sélection des produits T voiture cellulaire optimales pour le succès thérapeutique in vivo. Des essais in vitro standard de tumeur-lysis échouent souvent afin de refléter le véritable potentiel antitumoral des cellules T de la voiture en raison de la durée relativement courte de co-culture et des lymphocytes T haut ratio de tumeur. Nous décrivons ici une méthode de culture in vitro de co pour évaluer voiture T cell récursive tuant potentiel avec des charges de cellule tumorale élevée. Dans ce test, la fonction cytotoxique à long terme et la capacité de prolifération des cellules T de voiture sont examinées in vitro pendant 7 jours avec cibles tumorales supplémentaire administrées à la co-culture tous les deux jours. Ce dosage peut être couplé avec l’activation des cellules T profilage, épuisement et phénotypes de la mémoire. À l’aide de ce test, nous avons distingué avec succès les différences phénotypiques et fonctionnelles entre CD4+ et CD8+ T voiture cellules contre le glioblastome (GBM), reflétant leur activité antitumorale in vivo différentielle dans orthotopique modèles de xénogreffes. Cette méthode fournit une approche facile pour évaluer la puissance de cellules de T de voiture et d’élucider les variations fonctionnelles à travers différents produits de cellules de T de voiture.

Introduction

L’immunothérapie utilisant des récepteurs de l’antigène chimérique (voiture)-ingénierie des cellules T a vu des résultats prometteurs contre les lymphocytes B malignes1,2,3,4, alors que le potentiel de ciblage des autres tumeurs continue d’être sous enquête rigoureuse5,6,7. Grands progrès ont été réalisés afin d’optimiser la construction voiture, procédé de fabrication et patient pré-infusion schémas6,7,8, et approches de la biologie synthétique roman devraient augmenter leurs persistance, de sécurité et de tumeur spécificité9,10. Cependant, il a été difficile et fastidieux d’évaluer correctement le potentiel thérapeutique des cellules T de la voiture afin de guider le choix le plus approprié pour la traduction clinique. Le modèle plus établi jusqu’à présent pour évaluer la fonction des cellules T de la voiture est en souris immunodéficientes portant de xénogreffes tumorales humaines, auquel cas voiture NKT est examinées pour l’efficacité antitumorale et comparativement à cellule titré doses11,12 , 13 , 14 , 15. ces études murins in vivo sont fastidieuses et chronophages, surtout lorsqu’un grand nombre de paramètres de dépistage. En outre, in vivo études peuvent être freinées par l’accessibilité des souches de souris, les installations de soins aux animaux et les techniques de gestion d’animaux. Par conséquent, il y a un besoin de développer des essais in vitro plus pratiques permettant des lectures rapides d’activite d’effecteur, qui reflètent aussi fidèlement la fonction antitumorale in vivo de ces lymphocytes T.

Les méthodes conventionnelles pour déterminer la cytotoxicité des cellules T in vitro ont mis l’accent sur la détection de dégranulation, la production de cytokines et la capacité à lyser les cellules cible marquée radio-isotope (p. ex., tests de libération de Chrome). Alors que ces tests ont un caractère informatifs permettant de définir la spécificité cellulaire T de voiture et la reconnaissance de la cible redirigée, ils échouent souvent à réfléchir in vivo potentiel antitumoral d’ingénierie T cellules12,13,16. Dans certains cas, en vitro tuant l’activité dans les essais à court terme ont montré une corrélation inverse avec la fonction antitumoral in vivo16. Cette incompatibilité est vraisemblablement le résultat des ratios élevés effecteur : cible (E:T) utilisés dans ces essais in vitro et donc l’impossibilité pour différencier les produits de cellules de T de voiture qui sont sujettes à épuisement17. En revanche, au cours de l’éradication des tumeurs in vivo T cellules répondent habituellement contre des charges de grande tumeur, ce qui nécessite donc plusieurs tours de tuer au volant par la suite des lymphocytes T la différenciation et l’épuisement18,19, 20, qui est l’un des principaux obstacles contre la clairance apparente de tumeur par voiture T cellules12,13. Pendant ce temps, à plus court terme meurtre in vitro tests font également pas des différences de lecture dans la prolifération des cellules T, tandis que chez les cellules traitées voiture T la capacité pour l’expansion des cellules T de voiture est fortement corrélée avec les réponses cliniques4. Ainsi, l’essai in vitro approprié devrait récapituler les conditions de charge tumorale élevée, induction d’épuisement de lymphocytes T et permet la lecture de l’expansion des cellules T.

Nous décrivons ici une stratégie afin d’évaluer les cellules de T de voiture pour tumeur répétitive tuant potentiel, avec un test simple de co-culture in vitro. Paramètres d’activité différents lymphocytes T Effecteurs peuvent être examinés en même temps, y compris la mort cellulaire cible, expansion des cellules T de la voiture et les phénotypes associés à la mémoire ou l’épuisement. Les résultats générés par cet essai bien corrèlent avec l’effet antitumoral in vivo des cellules T de la voiture et peuvent être exploitées pour évaluer la puissance des produits cellulaires T de voiture. Alors que nous décrivons un test afin d’évaluer les cellules de T de voiture IL13Ra2 ciblées contre primaire GBM lignes21, il peut être facilement adapté à n’importe quelle plateforme de cellules de T de voiture.

Protocol

Notre CISR ne nécessite pas de révision du présent protocole. Nous recevons des échantillons de tumeur glioblastome frais mis au rebut de la ville de Hope pathologie département qui sont codées, et notre laboratoire ne peut pas accéder à la clé. Nous recevons les spécimens avec des données que sur l’état de maladie et de traitement préalable au moment de la biopsie/résection, avec aucune donnée d’identification. 1. préparation de support Préparer les cellules souches neurales milieux pour culture de lignées de cellules primaires GBM : DMEM:F12, 01:50 B27, 5 µg/mL héparine et 2 mmol/L, L-glutamine ; additionné de 20 facteur de croissance épidermique (EGF) ng/mL et 20 ng/mL facteur de croissance basique des fibroblastes (FGF) deux fois par semaine (voir Table des matières). Préparer les médias de lymphocytes T : 15 X-VIVO contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) ; additionné de 70 UI/mL rhIL-2 et 0,5 ng/mL rhIL-15 chaque 48 h (voir Table des matières). Préparation des milieux de culture co : prendre des cellules souches neurales médias sans supplément EGF et FGF et ajoutez 10 % FCS. Préparer des FACS (FSS) de solution de coloration : HBSS, 2 % FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL). 2. préparation des cellules tumorales GBM Récolter les sphères de tumeur basse-passage GBM (TSs) par centrifugation à 300 x g pendant 4 min et jeter le surnageant.Remarque : Tumeur GBM sphères (TSs) sont générés à partir résection de tumeurs comme décrit plus haut22,23,24et maintenue par les médias de cellules souches neurales, en couveuse avec 5 % de CO2 à 37 ° C. Réchauffez les milieux de culture co dans un bain-marie à 37 ° C. Ajouter 1 mL d’accutase froid à GBM TSs, dissocier TSs en pipettant également, pour les 30-60 s et arrêter la dissociation en ajoutant 5 mL de milieux de culture co chaud.Remarque : GBM TSs ne doivent pas être conservés sur accutase pendant plus de 5 min. Récolter les cellules GBM par centrifugation à 300 g pendant 4 min, jeter le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 2 mL de milieu de culture co. Déterminer la concentration de cellules à l’aide d’un compteur de viabilité de cellules.Remarque : Viabilité cellulaire doit être > 70 %. 3. préparation des cellules de T de voiture Moins de 24h avant le dosage, prenez 100 µL de cellules de T de voiture cultivées dans un tube de cytométrie en flux et ajouter 2 mL de FSS.Remarque : Les cellules de T de voiture ont été générés comme décrit plus haut11,21 et cultivées dans des milieux de lymphocytes T. Centrifugation à 300 g pendant 4 min, puis jeter le surnageant. Ajouter 2 mL de FSS pour laver les cellules, centrifuger à 300 x g pendant 4 min et jeter le surnageant. Colorer les cellules avec des anticorps approprié pour indiquer l’expression de la voiture à 4 ° C pendant 30 min.Remarque : Par exemple, si une voiture IL13Rα2 ciblés décrits précédemment25 est utilisé, puis colorer avec un anticorps anti-IL13. Laver deux fois avec 2 mL de FSS et analyser exn de voiture à l’aide d’un cytomètre en flux. Déterminer le % de voiture sur les cellules T à l’aide de la stratégie de blocage illustrée à la Figure 1B. Lors de la journée de co-culture, récolter toutes les cellules de T de voiture par centrifugation à 300 g pendant 4 min, jeter le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 2 mL de milieu de culture co. Déterminer la concentration de cellules à l’aide d’un compteur de viabilité de cellules.Remarque : Viabilité cellulaire doit être > 70 %. 4. configurer la tumeur — co-culture de lymphocytes T Diluer les cellules tumorales à une concentration de 0,16 millions/mL avec les milieux de culture co. Basé sur voiture %, diluer les cellules à une concentration de cellules en voiture+ 0,04 millions/mL avec les milieux de culture co voiture T.Remarque : Par exemple, si la voiture est de 50 % et la concentration cellulaire T est de 0,4 millions/mL, puis réaliser une dilution au 1:5 pour obtenir la concentration finale de 0,04 millions voiture+ cellules/mL. Pipetter 100 µL de cellules tumorales dilué dans chaque puits d’une plaque 96 puits à fond plat culture de tissus. Pipetter 100 µL de cellules de T de voiture dilués dans chaque cupule contenant mix et les cellules tumorales bien.Remarque : Chaque co-culture de cellules de tumeur-T est analysé à 4 points dans le temps. 4-6 répétitions pourraient se révéler nécessaires à chaque fois point basé sur une analyse différente, mais < 3 répétitions par point dans le temps n’est pas recommandée ; voir le tableau 1 pour une platemap représentatif. Maintenir la plaque en a 37 ° C, 5 % CO2 incubateur. 5. tumeur cellulaire reprise du traitement Remarque : Reprise du traitement se déroule à 2, 4 et 6 jours après l’installation initiale de co-culture (Figure 1A). Récolter et se dissocient GBM TSs tel que décrit ci-dessus (étapes 2,1 à 2,6). Remettre en suspension les cellules GBM à une concentration de 0,64 millions/mL. Déterminer les puits de co-culture nécessitant une reprise du traitement (voir tableau 1) et retirez délicatement le dessus de chaque puits 50 médias µL. Ajouter 50 µL de la suspension cellulaire GBM dans chaque puits et bien mélanger, puis remettre la plaque en a 37 ° C, 5 % CO2 incubateur. 6. récolter des échantillons et l’analyse par cytométrie en flux d’écoulement Remarque : Les échantillons seront récoltées au poste de jours 1, 3, 5 et 7, que la configuration initiale de co-culture, avec 1, 2, 3 et 4 tours du challenge de la tumeur, respectivement. Solution de trypsine-EDTA 0,05 % préchauffez au bain-marie à 37 ° C. Déterminer les puits qui ont besoin de récolte et de transférer les médias dans une nouvelle plaque de 96 puits fond rond. Pipetter 50 µL de trypsine-EDTA dans les puits pour digérer les cellules tumorales restantes à 37 ° C pendant 5 min. Sous un microscope, confirmer que les cellules ont détaché du fond. Pipetter autour du fond bien remettre en suspension les cellules individuelles, puis transférer la trypsine-EDTA contenant des cellules individuelles aux puits de la plaque à 96 puits fond rond correspondants. Centrifuger la plaque à 96 puits fond rond à 300 x g, 4 ° C pendant 4 min, puis jeter liquide surnageant. Ajouter 200 µL/puits de la FSS pour laver les cellules, la centrifuger à 300 x g, la 4 ° C pendant 4 min, puis jeter le surnageant. Remettre les cellules en 100 µL/puits FSS contenant des anticorps (voir Table des matières), et tache les cellules à 4 ° C pendant 30 min. Ajouter 100 µL/puits SFS aux cellules, centrifuger à 300 g, 4 ° C pendant 4 min, puis jeter surnageant. Ajouter 200 µL/puits de la FSS pour laver les cellules, la centrifuger à 300 x g, la 4 ° C pendant 4 min, puis jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 100-200 µL/puits de FSS avec 500 ng/mL DAPI, puis analyser les échantillons par cytométrie en flux. 7. fonctionnelle et Phen Otypic analyse des cellules de T de voiture Récupérer les fichiers de données du cytomètre en flux et porte tous (DAPI-) des cellules vivantes (Figure 1C). Quantifier les cellules tumorales par blocage du CD45– population et cellules de T de voiture par blocage du CD45+, voiture + population (Figure 1C).Remarque : Si les cellules tumorales expriment CD45 (par exemple les cellules de lymphome Raji), anti-CD3 coloration peut être utilisée pour différencier les cellules T de cellules tumorales. Tracer la cellule tumorale et le nombre de cellules de T de voiture au cours du temps. Identifier l’activation des cellules T par la co-expression de 4-1BB et CD69.Remarque : Ces marqueurs de surface peuvent être utilisés pour analyser des lymphocytes T d’activation 6 à 24 heures post initial co-culture. Identifier épuisement de lymphocytes T par l’expression de PD-1, 3-LAG et TIM-3. Identifier les cellules T état de la mémoire par l’expression de CD45RO et CD62L.

Representative Results

À l’aide de l’essai décrit ci-dessus, nous avons distingué la puissance différentielle effecteur et tuant dynamique par l’intermédiaire de CD4+ et CD8+ T voiture cellules. Les résultats présentés ici illustrent la différence entre CD4+ et CD8+ T voiture cellules, produits d’un donneur sain et indépendant de notre précédente publication21. Grâce à un test de dégranulation standard, nous avons pu observer que les deux CD4+ et CD8+ T voiture cellules est devenu tout aussi activées contre des cellules GBM qui expriment l’antigène cible, comme indiqué par l’expression des CD107a et des cytokines intracellulaires (Figure 2A). Toutefois, à l’aide de l’essai de défi de tumeur répétitives, nous avons constaté que CD4+ mais pas CD8+ T voiture cellules ont la capacité de tuer rondes multiples (Figure 2B). CD4+ T voiture cellules également atteinte expansion mieux par rapport à des cellules CD8 + au cours de cet essai (Figure 2C). La différence de dilatation entre les sous-ensembles de cellules de T de voiture ont été seulement observés de D3 après deux tours de défi de tumeur (1:12 E:T), tandis que la différence de la cytotoxicité a été observée dès D5 après trois manches du challenge (1:20 E:T) de la tumeur, ce qui indique que les essais à court terme n’a pas pu élucider les différences dans l’activité des différents produits de cellules de T de voiture. Lorsque 1:1 mélangé CD4+ et CD8+ T de voiture cellules ont été appliqués à ce test, ils ont été trouvés à surperformer CD8+ mais pas de CD4 des cellules+ T de voiture sur la cytotoxicité à long terme (Figure 2B). L’expansion des CD8+ T de voiture cellules a été induite par le CD4 conjointement appliquées, tandis que CD4 des cellules+ + expansion des cellules T de voiture est inhibée en présence de CD8+ des cellules (Figure 2C). Pour expliquer le mécanisme qui distingue l’activité effectrice entre CD4+ et CD8 cellules+ T de voiture, nous avons d’abord confirmer que 24h après initiale co-culture, deux CD4+ et CD8+ T voiture cellules étaient activés comparable (Figure 3 A). Pendant ce temps, comme en témoigne l’expression CD45RO et CD62L, deux CD4+ et CD8+ T voiture cellules montrent une transition de mémoire centrale (CD45RO+, CD62L+) à la mémoire de l’effecteur (CD45RO+, CD62L–) phénotype au cours du défi répétitives de tumeur (Figure 3B). Puis nous avons caractérisé les cellules D3 de ce test, un temps avant que les sous-ensembles de cellules de T de voiture commence à afficher une différence fonctionnelle. Épuisement de lymphocytes t a été marquée par la co-expression de récepteurs inhibiteurs PD-1, 3-LAG et TIM-315,21, qui a montré que CD8+ T voiture cellules étaient plus enclins à l’épuisement par rapport aux CD4+ voiture T cells () Figure 3 C). en outre, il a été vu aucune différence sur CD8+ épuisement de cellules T voiture dans la présence ou l’absence des CD4 appliquée conjointement+ cellules (Figure 3C), ce qui indique qu’induite par le CD4 CD8+ expansion des cellules T de voiture n’est pas associé à une meilleure fonction effectrice. Ensemble, les résultats de cette analyse a identifié que CD4+ T voiture cellules CD8 surperformé+ cellules spécifiquement dans la cytotoxicité à long terme. Malgré la cytotoxicité similaire à court terme (1-3 jours, une fois résorbées), CD4 des cellules de+ T voiture fonction effectrice soutenue après provocation tumeur répétitive, tandis que CD8+ cellules devient épuisés et pas réussis à maîtriser la croissance des cellules tumorales. Quand les deux sous-ensembles ont été mélangés, CD4+ T voiture cellules favorisé l’expansion de CD8+ voiture T cells, mais l’état d’épuisement de CD8+ cellules n’étaient pas améliorées, résultant en l’absence d’effet synergique entre les deux groupes. Une différence semblable entre CD4+ et CD8+ T voiture cellules a été vu dans un modèle in vivo comme décrit précédemment21. En effet, CD8+ T voiture cellules étaient capables de médiation à court terme clairance de tumeur mais suivie avec récidive de l’antigène-positif ; en revanche, les CD4+ traitement des cellules T de voiture permis à long terme de l’éradication tumeur21, qui fait penser à leur potentiel de meurtre répétitives à l’aide de l’essai de reprise du traitement in vitro. Figure 1 : Stratégie de schéma et analyse du test défi répétitives. (A) schéma et chronologie du test défi tumeur répétitives. Pour chaque puits, lymphocytes T de voiture ont d’abord cultivés conjointement avec des cellules PBT030-2 GBM (cellules voiture + 4 000, 16 000 cellules tumorales) et re-contesté avec 32 000 cellules tumorales tous les deux jours (D2, D4 et D6). Analyse de la cellule tumorale et le nombre de cellules T de la voiture, ainsi que phénotype cellulaire T voiture est effectuée à D1, D3, D5 et D7. (B) Gating stratégie afin de déterminer le % de voitures en T des cellules avant de configurer la co-culture. (C) Gating stratégie de cellules vivantes, des cellules tumorales et des cellules de T de voiture de l’essai de défi répétitives. (D) tumeur des cellules nombre à des moments différents de l’essai de reprise du traitement, conjointement mis en culture avec des cellules de T untransduced. Barres d’erreur = ±ét. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Défi répétitive test révèle des différences dans la mise à mort et prolifération puissance entre CD4+ et CD8+ T voiture cellules. (A) dégranulation et cytokines intracellulaires la coloration des CD4+ et CD8+ T voiture cellules après 5 h de co-culture avec des cellules GBM (E:T = 1:1). CD4 (B)+, CD8+ ou mixtes (CD4:CD8 = 1:1) voiture NKT donnèrent leur dosage défi répétitives, et les cellules tumorales viables ont été quantifiées. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 comparativement à CD4+, avec ANOVA à plusieurs Tests de comparaison de Bonferroni. CD4 (C)+ et CD8+ expansion des cellules T de voiture au cours de l’essai de défi tumeur répétitives. Comparaison de (gauche à droite) CD4+ vs CD8+, seul sous-ensemble ; CD4+ vs CD8+, au sein du groupe « mixte » ; CD4+, une seule / mixé ; CD8+, une seule / mixé. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 en utilisant le test t de l’étudiant un non appariés. Barres d’erreur = ±ét. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Analyse du phénotype des lymphocytes T au cours de l’essai de défi répétitives. (A) 4-1BB et CD69 souillure sur les cellules de T de voiture au D1 du dosage. (B) CD45RO CD62L souillure et de lymphocytes T de la voiture avant de contester le dosage (entrée) et à D3 et D7 du dosage. (C) la co-expression de PD-1, 3-LAG et TIM-3 sur les cellules de T de voiture à D3 du dosage. (En haut) Blocage des stratégies pour identifier les cellules T exprimant les récepteurs inhibiteurs 1, 2 ou 3. (En bas) Comparaison de : CD4+ (sous-ensemble unique), les cellules CD8+ (sous-ensemble unique), les cellules CD8+ cellules (au sein du groupe « mixte »). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Tableau 1 : Carte de plaque représentatif de l’installation de reprise du traitement.

Discussion

Cette analyse de défi de cellules de tumeur répétitives propose une démarche pratique pour évaluer la puissance de la fonctionnelle de cellule T de voiture, en utilisant une configuration in vitro qui récapitule la charge tumorale élevée associée à des modèles de tumeurs in vivo. Au cours de cet essai de 7 jours, les cellules de T de voiture subissent quatre séries de défi de la tumeur (co-culture initiale et reprise de x 3), créer un environnement où épuisé les lymphocytes T peuvent perdre leur capacité à répondre au défi de tumeur malgré une puissante réponse initiale. Élimination des cellules tumorales et l’expansion des cellules T de voiture représentent deux lectures fondamentales qui peuvent être acquises de cet essai, tandis que les phénotypes des cellules T de voiture peuvent être facilement analysés par coloration de surfaces ou intracellulaires des marqueurs qui indiquent l’activation des cellules T, épuisement et/ou mémoire. Ce dosage est également pratique pour combiner avec analyse impartiale de voiture T cellules transcriptome, protéome ou phosphore-proteome21,26et polyfonctionnalité de cellules T qui a été adoptée afin de prédire les réponses cliniques27. En outre, les cellules tumorales peuvent également être testés pour leur réponse adaptative contre l’immunité cellulaire T tels que la sécrétion de cytokine28. Puisque les échantillons sont récoltés à plusieurs moments, ce dosage permet non seulement statique, mais aussi une analyse dynamique du comportement de cellules T de la voiture lorsqu’elle répond au trop grand nombre de cellules tumorales.

L’essai est particulièrement puissant en comparant la puissance d’effecteur des cellules de T de voiture ciblant le même antigène, mais avec différentes conceptions et/ou les procédés de fabrication. Nous avons utilisé ce test pour identifier que CD4+ T voiture cellules étaient capables de médiation supérieure à long terme fonction effectrice que CD8+ cellules21. On a aussi montré que cette efficacité in vivo de la voiture est en corrélation avec la cytotoxicité aux périodes ultérieures (D5-D7) au cours de ce test, plus loin en soulignant la nécessité d’utiliser le défi de tumeur répétitives pour évaluation in vitro de cellules T de la voiture. Bien que les cellules GBM étaient utilisées comme l’exemple des cellules cibles ici, cet essai pourrait être adopté facilement à une combinaison de différentes cellules T-tumeur. Notamment, comportement de cellules T de la voiture peut également varier à densités différentes de l’antigène et ingénierie des cellules cancéreuses pour exprimer différents niveaux d’antigènes ciblés fournis l’outil pour étudier les événements moléculaires séquentiels sur voiture reconnaissance29. Par conséquent, cette analyse peut également être exploitée afin d’examiner le modèle d’activation de certaines cellules T voiture contre différentes cibles.

Puisque la viabilité cellulaire cible et l’expansion des cellules T de la voiture sont deux afficheurs initiaux de ce test, il est essentiel que toutes les cultures co commencent par viables (> 70 %) tumeur et les cellules T. Lorsque vous effectuez les processus de reprise du traitement, l’action des médias aspirante (étape 5.3) ne devrait pas modifier tumeur et les cellules de T dans le fond des puits, afin de ne pas introduire des variations inutiles des comtes de cellules. Lorsque vous effectuez ce test sur des lignées cellulaires de suspension cible, il est recommandé de récolter les cellules restantes par centrifugation avant la réexposition de cellules tumorales.

Une des limitations de ce test est que les paramètres d’installation (E:T ratios de co-culture initiale et reprise du traitement) doit être ajustée selon différentes combinaisons de voiture-tumeur. Par exemple, si les cellules tumorales expriment un degré considérable de molécules immuno-inhibitrices (PD-L1, par exemple), un ratio plus élevé de E:T est recommandé étant donné que l’ensemble tuant efficacité est altérée par rapport aux cellules tumorales PD-L1 faible. Avant d’appliquer le test de nouvelles combinaisons de voiture-tumeur, une étude pilote est recommandée afin de déterminer les conditions optimales, ce qui permet habituellement la plus puissante voiture NKT analysés avec le test d’éliminer > 80 % des cellules tumorales à la fin. Contact cellule-cellule directe est nécessaire pour voiture médiée par les lymphocytes T tuer, si les cellules tumorales ont été marqués par fluorescence, puis le panneau de cytométrie doit être ajusté en conséquence (par exemple si les cellules tumorales ont été marqués au GFP, puis tout FITC conjugué anticorps ne doivent pas être utilisés).

L’activité clinique des cellules de T de voiture contre les tumeurs malignes de cellules B a conduit à deux médicaments approuvés par la FDA. Cependant, la réponse a montré une variation substantielle à travers différents patients27,30,31, qui a été élucidée en corrélation avec les propriétés phénotypiques de la voiture produits30. Cet essai de défi de tumeur répétitives in vitro plus fournit une approche qui testent la puissance d’effecteur de voiture en plus de la caractérisation phénotypique et la production de cytokines polyfonctionnalité et permet un débit plus élevé projection du produits cliniques en comparaison de modèles in vivo de tumeur tout en conservant la fidélité prédictive. Dans l’ensemble, cet essai pourrait être utilisé pour le test fonctionnel des lymphocytes T pour la conception de voiture T cell, développement préclinique et clinique.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) grant TR3-05641 et subventions NIH CA33572 P30 (carottes). P.S. est pris en charge par NCI bourse 1F99CA234923-01.

Materials

0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium Corning MT25051CI
1M Hepes Irvine Scientific 9319
200 mM L-Glutamine Cambrex Bio Science 17-605E
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade Invitrogen D21490
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) Novartis Oncology NDC 0078-0495-61
Anti-CD137, PE BD Biosciences 555956 4B4-1
Anti-CD19, PE-Cy7 BD Biosciences 557835 SJ25C1
Anti-CD3, PERCP BD Biosciences 340663 SK7
Anti-CD4, FITC BD Biosciences 340133 SK3
Anti-CD45, PERCP BD Biosciences 340665 2D1
Anti-CD45RO, PE BD Biosciences 561137 UCHL1
Anti-CD62L, APC BD Biosciences 559772 DREG-56
Anti-CD69, APC BD Biosciences 340560 L78
Anti-CD8, APC-Cy7 BD Biosciences 348793 SK1
Anti-IL-13, PE BD Biosciences 340508 JES10-5A2
Anti-LAG-3, PE eBiosciences 12-2239-41 3DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7 BioLegend 329921 EH12.2H7
Anti-TIM-3, APC eBiosciences 17-3109-42 F38-2E2
B-27 Serum-Free Supplement (50X) Invitrogen 17504-044
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) Corning Life Sciences 3596
Defined fetal bovine serum,HI IR Hyclone Labs SH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine MediaTech, Inc. 15-090-CV
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L Invitrogen 11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES Fisher Scientific MT10092CV
HBSS Irvine Scientific 9224
Heat-Inactivated FCS Hyclone SH30070.03
Heparin Sodium(1,000 U/ml) American Pharmaceutical 401811B
MACSQuant Milteni Biotech Inc. BIS013220 
PBS 1X W/CA & MG Irvine Scientific 9236
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) VWR Scientific Products PB15009A
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG-200
Recombinant human FGF R&D Systems 233-FB
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) CellGenix, US Operations tF0297
Sodium Azide (NaN3) Sigma S8032
Sorvall ST40R Thermo Scientific 41693700
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML  IRVINE SCIENTIFIC CORP 6472
Tecnol Procedure Mask Kimberly-Clark 47117
X-VIVO 15 Lonza BW04-744Q
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References

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Citer Cet Article
Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D., Yang, X., Forman, S. J., Brown, C. E. In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function. J. Vis. Exp. (144), e59275, doi:10.3791/59275 (2019).
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