体外肿瘤细胞恢复对 chimeric 抗原受体 t 细胞抗肿瘤功能的预测评价

我们的 irb 不需要对该协议进行审查。我们收到了来自希望市病理学系的废弃新鲜胶质母细胞瘤肿瘤样本, 这些样本是编码的, 我们的实验室无法获得关键。我们只收到有关生物切除术时的早期治疗和疾病状态的数据的标本, 没有识别数据。 1. 媒体准备 制备用于培养原代 gbm 细胞系的神经干细胞培养基: dm:f12、1:50 b27、5μgml 肝素和 2 mmol l-谷氨酰胺;补充 20 ngml 表皮生长因子 (egf) 和 20 ngml 碱性成纤维细胞生长因子 (fgf) 每周两次 (见材料表)。 制备 t 细胞培养基: x-vivo 15, 含有10% 的胎儿小牛血清 (fcs);每48小时补充 70份. 准备共培养培养基: 服用无 egf 和 fgf 补充的神经干细胞培养基, 并添加10% 的 fcs。 制备流化物染色溶液 (fss): hbss, 2% fcs, nan3 (0.5 g 500 ml)。 2. gbm 肿瘤细胞的制备 在 300 x g 的离心过程中, 以4分钟的速度收获低通道 gbm 肿瘤球体 (ss), 并丢弃上清液。请注意:gbm 肿瘤球体 (ts) 是由切除的肿瘤产生的, 如上文所述, 22, 23, 24, 并在神经干细胞中保持, 在 37°c的孵化器中使用5% 的 co2。 在37°c 的水浴中进行预热共培养介质。 在 gbm ts 中加入1毫升冷配酸酶, 通过移液30至60秒分离 tss, 加入5毫升的温培养培养基来阻止分离。请注意:gbm ts 在淀粉酶上的保存时间不应超过5分钟。 以 300 x g离心4分钟采集 gbm 细胞, 丢弃上清液, 并在2毫升共培养培养基中重新悬浮细胞。 使用细胞活力计数器确定细胞浓度。请注意:细胞活力必须是 & gt;70%。 3. car t 细胞的制备 在检测前24小时内, 将100μl 培养的 car t 细胞放入流式细胞仪管中, 加入2毫升 fss。请注意:像前面描述的那样,在t 细胞培养基中培养了 t 细胞。 离心时间为 300 x克, 4分钟, 丢弃上清液。 加入2毫升 fss 清洗细胞, 以 300 x g离心剂 4分钟, 并丢弃上清液。 用适当的抗体染色细胞, 表明在4°c 下的 car 表达30分钟。请注意:例如, 如果使用了以前描述的il13rα2靶向 car 25, 则使用抗 il13 抗体进行染色。 用 fss 2 毫升清洗两次, 并用流式细胞仪分析 car 外显子。 使用图 1b所示的门控策略确定 t 细胞上的 car 百分比。 在共培养日, 以 300 x g离心 3分钟, 在共培养培养基中丢弃上清液, 并重新悬浮细胞, 以300xg 的速度收获所有 car t 细胞。 使用细胞活力计数器确定细胞浓度。请注意:细胞活力必须是 & gt;70%。 4. 建立肿瘤-t 细胞共培养 用共培养培养基稀释肿瘤细胞, 浓度为 0.16百万/升。 以 car% 为基础, 将 car t 细胞稀释至0.04亿例 car + cellsl 浓度。请注意:例如, 如果 car 为 50%, t 细胞浓度为0.4 万/毫升, 则进行1:5 稀释, 以获得0.04 万辆 car+ cells/ml 的最终浓度。 将稀释后的肿瘤细胞移液器100μl 放入96孔平底组织培养板的每口井中。 将稀释后的 car t 细胞移液器100μl 放入每口含有肿瘤细胞的井中, 搅拌良好。请注意:每个肿瘤-t 细胞共培养将在4个时间点进行分析。根据不同的分析, 每个时间点可能需要4-6 个复制, 但 & lt;3 replicates per time point is not recommended;有关具有代表性的平台图, 请参见表 1 。 将板材保持在37°c、5% co2孵化器中。 5. 肿瘤细胞 请注意:reech置在初始共培养设置后的2天、4天和6天进行 (图 1a)。 如上文所述, 收获和离解 gbm tss (步骤 2.1-2.6)。 在0.64 万/毫升的浓度下再弹性 gbm 细胞。 确定需要重新挑战的共培养井 (见表 1), 并从每口井顶部仔细去除50μl 介质。 将50μl 的 gbm 细胞悬浮液加入每口井, 搅拌均匀, 然后将板放回37°c、5% co2孵化器中。 6. 采集样品和流动细胞仪分析 请注意:样本将在最初的共培养设置后的1、3、5和7天采集, 分别有1、2、3和4轮肿瘤挑战。 在37°c 的水浴中预热0.05% 的胰蛋白酶-edta 溶液。 确定需要收获的井, 并将介质转移到新的圆底96井板中。 将胰蛋白酶 edta 50μl 移入井中, 在37°c 下消化剩余的肿瘤细胞5分钟。 在显微镜下, 确认细胞已从底部分离。 在井底周围的移液器重新悬浮分离的细胞, 然后将含有分离细胞的胰蛋白酶 edta 转移到96井板的相应井中。 在 300 x g、4°c 的温度下离心96孔圆盘 4分钟, 然后丢弃上清液。 加入 200μl/well 的 fss 清洗细胞, 离心机在 300 x克,4°c 4分钟, 然后丢弃上清液。 在含有抗体的 100μl/well fss 中重新移植细胞 (见材料表), 并在4°c 下将细胞染色30分钟。 在细胞中加入 100μlwell fss, 在 300 x g、4°c 的温度下离心 4分钟, 然后丢弃上清液。 加入 200μl/well 的 fss 清洗细胞, 离心机在 300 x克,4°c 4分钟, 然后丢弃上清液。 用 500ngml dapi 对 fss 的100-200μl/井进行再利用, 然后用流式细胞仪对样品进行分析。 7. car t 细胞的功能分析和 pen o典型分析 从流式细胞仪中检索数据文件, 并启动所有实时 (dapi-) 单元格 (图 1c)。 通过对 cd45-群体和 car t 细胞进行门控, 通过对 cd45+、car + 种群进行门控, 对肿瘤细胞进行定量 (图 1c)。请注意:如果肿瘤细胞表达 cd45 (如拉吉淋巴瘤细胞), 抗 cd3 染色可用于区分 t 细胞和肿瘤细胞。 通过时间过程绘制肿瘤细胞和 car t 细胞数。 通过4-1bb 和 cd69 的共表达来识别 t 细胞的激活。请注意:这些表面标记可用于分析 t 细胞激活6-24小时后的初始共培养。 通过 pd-1、lag-3 和 tim-3 的表达来识别 t 细胞的消耗。 通过 cd45ro 和 cd62l 的表达来识别 t 细胞记忆状态。