Сравнение стволовых клеток человека, полученных нейронов в предварительно собранных пластиковых микрофлюидных чипов

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1A,B показана схема предварительно собранного чипа COC, включая расположение основных каналов или отсеков, колодцев и микрогров. Разрозненный чип может установить различные жидкости микросреды в отсеке, как показано на изоляции пищевой краситель красителя(рисунок 1C). Протокол для подготовки предварительно собранного мульти-купе чипа дается в Nagendran и др., раздел 112. 1. Покрытие мульти-купе чипов для hSC-нейронов ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2A показан обзор процедур покрытия. Растворите поли-L-орнитин в дистиллированной воде культуры клеток, чтобы сделать 600 л раствора на чип рабочего раствора 20 мкг/мл. Приготовьте оставшиеся PBS слева после подготовки чипсов из скважин. При успомении убедитесь, что кончик трубы находится вдали от открытия канала.ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидные каналы должны оставаться заполненными в течение всей этой процедуры. Не аспирируйте жидкость из каналов/отсеков, только колодцы. Нагрузка 150 Л поли-L-орнитинов рабочего раствора в верхнем правом колодце. Подождите 90 с или до тех пор, пока жидкость не начнет заполнять нижний правый хорошо. Добавьте 150 л носителей в нижний правый цвет и подождите 5 минут, чтобы жидкость прошла через микрогры. Добавьте 150 л носителей в левый верхний цвет. Подождите 90 с, а затем добавить 150 л в левом нижнем колодце хорошо. Оберните держатель чипа (ы) с parafilm и поместите на 4 кв на ночь.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, поместите чип и держатель на 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч. Призадыхайтесь от носителей из скважин, гарантируя, что трубчатый наконечник находится вдали от открытия канала. Добавьте 150 л стерильной воды в верхний правый колодец. Подождите 90 с, а затем добавить 150 Л л в правом нижнем правом колодце. Подождите 5 минут, чтобы жидкость прошла через микрогры. Добавьте 150 л стерильной воды в левый верхний цвет, подождите 90 с, а затем добавьте еще 150 л в левый нижний. Повторите шаги 1.5-1.6. Оттаиваете ламинин медленно при 2-C до 8 градусов по Цельсию и подготовить 10 мкг /мл рабочего решения. Загрузите 150 л рабочего раствора ламинина в верхний правый укрядно. Подождите 90 с или до тех пор, пока жидкость не начнет заполнять нижний правый хорошо. Пипер 150 Л л в правом нижнем правом колодце. Подождите 5 минут, чтобы ламинин пройти через microgrooves. Добавьте 150 л ламинина в левый верхний цвет. Подождите 90 с, а затем добавить 150 л в левом нижнем колодце хорошо. Инкубировать чип в пределах его держателя в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия. Промыть чип с помощью PBS (без Ca2 и Mg2 “). Загрузите 150 Л ПБС в верхний правый колодец. Подождите 90 с или до тех пор, пока жидкость не начнет заполнять нижний правый хорошо. Добавьте 150 л PBS в нижний правый колодец и подождите 5 минут, чтобы PBS пройти через микрогры. Пиперт 150 Л PbS в верхний левый колодец. После 90 с пайптун 150 л в левом нижнем колодце. Аспирировать PBS от чипа, а затем промыть чип с NSC средств массовой информации (см. Таблица материалов). Загрузите 150 л носителей в верхний правый колодец. После 90 с или когда жидкость проходит через правый канал в нижний правый хорошо, добавить 150 Зл в правом нижнем правом хорошо. Подождите 5 минут, чтобы средства массовой информации течь через microgrooves. Добавьте 150 л носителей к верхнему левому колодцу и еще 150 кЛ в нижний левый колодец. Инкубировать чип в инкубаторе 37 градусов с 5% CO 2, чтобы предварительно кондиционировать чип до готовности к семени NSCs.ПРИМЕЧАНИЕ: Чипсы могут быть предварительно кондиционированы на ночь, если это необходимо. 2. Посев NSCs в многокомпонентный чип ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол используется коммерчески приобретенных NSCs, в отличие от нашей предыдущей публикации, которая началась с человеческих эмбриональных стволовых клеток5. В этом протоколе нервные стволовые клетки покрыны непосредственно в пластиковые чипы, где они дифференцируются в нейроны. Клетки могут размножаться как НСК (без дифференциации) до 2 проходов и храниться во флаконах в жидкости N2 для дальнейшего использования. Этот протокол использует флаконы NSC, хранящиеся в жидкости N2 после прохождения 1 или 2. На рисунке 2B показан обзор процедур покрытия. Оттепель NSCs в соответствии с инструкциями производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура применяется к NSCs h9-производное. Другие клеточные линии потребуют оптимизации плотности клеток. Подсчитайте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра и отрегулируйте с помощью носителей NSC, чтобы получить концентрацию 7 х 106 ячеек на мл. Аспирные носители из каждой скважины чипа. Избегайте аспирации носителей с основных каналов. Пипет 5 зл клеточного раствора в правом верхнем углу скважины, а затем 5 Зл в нижней правой скважине (70000 клеток всего). Убедитесь, что ячейки пипетки к основным отверстиям канала. Используйте микроскоп, чтобы проверить, что клетки вошли в канал. Подождите 5 минут, пока клетки прилипут к нижней части чипа.ПРИМЕЧАНИЕ: Любой или оба отсека могут быть использованы для загрузки клеток. Пипом 150 л носителей NSC в правом верхнем углу, а затем 150 зл. Повторите на левой стороне. Инкубировать при 5% CO2,37 градусов по Цельсию в подходящем увлажненного контейнере. После 48 часов, аспирировать NSC средств из скважин и заменить нервной дифференциации средств, добавив 150 qL к каждой верхней скважины и каждого дна хорошо. Культурные нейроны впределах 5% CO 2, 37 C инкубатора в подходящем увлажненного контейнере.ПРИМЕЧАНИЕ: Средства массовой информации должны быть заменены каждые 2-3 дня. Из-за небольших объемов, используемых в чипе, испарение даже в увлажненный инкубатор может существенно повлиять на жизнеспособность клеток. Используйте подходящий вторичный контейнер для обеспечения дополнительной влажности для долгосрочной культуры клеток с чипом (см. Таблицаматериалов). 3. Вирусная флуоресцентная маркировка hSC-нейронов внутри чипа ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько вирусов может быть использован для обозначения нейронов в чипе. Инструкции ниже описывают использование G-удаленных бешенства-mCherry или -eGFP вируса. Потенциально инфекционные материалы должны обрабатываться в соответствии с применимыми правилами и положениями и могут потребовать дополнительной подготовки и институционального утверждения. Теплый 400 евро свежих нервных носителей дифференциации на чип до 37 градусов по Цельсию. Удалите 50 л носителей из одного колодца аксонового отсека в центрифужную трубку, а затем добавьте в трубку 100 000 вирусных единиц модифицированного вируса бешенства.ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно распоряжаться отработанные кончики трубы и центрифуги труб, содержащих вирус. Удалите оставшиеся нервные дифференциации из аксонального отсека и поместите в центрифужную трубку. Хранить при 37 градусах По Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что каналы остаются заполненными жидкостью. Смешайте 50 л раствора вируса с 150 л разогретых носителей. Пипер 100 л к одной скважине аксона отсека и 100 Зл к другому отсеку аксона хорошо. Инкубировать в течение 2 ч в пределах инкубатора 37 градусов по Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: Разница в объемах между аксональными и соматическими отсеками помогает обеспечить пребывание вируса в аксональном отсеке во время инфекции/инкубационного времени. Изъять и избавиться от вирусных носителей.ВНИМАНИЕ: Не удаляйте жидкость в закрытых микрофлюидных каналах. Аккуратно pipet 75 л свежих носителей в один аксон отсек хорошо и пусть средства массовой информации текут через канал в другой аксон хорошо. Удалить носители из аксона отсека и распоряжаться должным образом. Повторите шаги 3.6 и 3.7. Заполните отсек аксона сохраненными носителями. Pipet дополнительные 50 л свежих носителей, если это необходимо, а затем вернуть чип в инкубатор. Это дополнительные свежие средства массовой информации, чтобы рассчитывать на потерю средств массовой информации во время передачи жидкости и испарения во время процесса.ПРИМЕЧАНИЕ: Видимая флуоресцентная маркировка с использованием этих модифицированных вирусов бешенства происходит на 48 ч и до 8 дней, после чего клеточная смерть инфицированных нейронов обычно происходит из-за токсичности вируса. Нейронная визуализация может быть выполнена как с другими стандартными платформами культуры (например, стеклянные блюда на дне), но особое внимание необходимо для поддержания достаточной влажности, чтобы предотвратить испарительные потери. 4. Флюидическая изоляция, акотомия и иммуностоина внутри чипа Следуйте жидкостной изоляции, акотомии, и иммунонаблюдения с чипом, как описано в Nagendran и др.12.