Compartimentalização de neurônios derivados de células-tronco humanas dentro de chips de plástico Microfluídico pré-montados

Nota: a Figura 1a, B mostra um esquema do chip COC pré-montado, incluindo os locais dos principais canais ou compartimentos, poços e microranhuras. O chip compartimentalizado pode estabelecer microambientes fluídico distintos dentro de um compartimento como demonstram o isolamento da coloração corante alimentar (Figura 1C). O protocolo para a preparação do chip multicompartimento pré-montado é dado em Nago et al., seção 112. 1. revestimento de multi-compartimento de chips para hSC-neurônios Nota: a Figura 2a mostra uma visão geral dos procedimentos de revestimento. Dissolva a poli-L-ornitina em água destilada de grau de cultura celular para fazer 600 μL de solução por chip de uma solução de trabalho de 20 μg/mL. Aspirar a PBS restante à esquerda depois de preparar as fichas dos poços. Ao aspirar, assegure-se de que a ponta do Pipet esteja longe da abertura do canal.Nota: os canais microfluílicos devem permanecer preenchidos para a totalidade deste procedimento. Não aspirar líquido dos canais/compartimentos, apenas os poços. Carga 150 μL de solução de trabalho de poli-L-ornitina no poço direito superior. Aguarde 90 s ou até que o líquido começa a encher o poço direito inferior. Adicione 150 μL de mídia ao poço inferior direito e aguarde 5 min para deixar o líquido passar pelos microgrooves. Adicione 150 μL de mídia ao poço esquerdo superior. Aguarde 90 s e, em seguida, adicione 150 μL à parte inferior esquerda bem. Enrole o suporte do chip (s) com parafilm e coloque a 4 ° c durante a noite.Nota: Alternativamente, coloque o chip e o suporte a 37 ° c durante 1 h. Aspirar a mídia dos poços, assegurando que a ponta Pipet é colocada longe da abertura do canal. Adicione 150 μL de água estéril ao poço direito superior. Aguarde 90 s e, em seguida, adicione 150 μL à direita inferior bem. Aguarde 5 min para deixar o líquido passar através dos microgrooves. Adicione 150 μL de água estéril ao poço esquerdo superior, aguarde 90 s e, em seguida, adicione outro 150 μL ao poço inferior esquerdo. Repita os passos 1.5-1.6. Descongelar a laminina lentamente a 2 ° c a 8 ° c e preparar uma solução de trabalho de 10 μg/mL. Carregar 150 μL da solução de trabalho de laminina para o poço superior direito. Aguarde 90 s ou até que o líquido começa a encher o poço direito inferior. Pipet 150 μL para a parte inferior direita bem. Aguarde 5 min para deixar a laminina passar pelos microgrooves. Adicionar 150 μL de laminina ao poço superior esquerdo. Aguarde 90 s e, em seguida, adicione 150 μL à parte inferior esquerda bem. Incubar a microplaqueta dentro de seu suporte para 2 h em 37 ° c. Enxague o chip com PBS (sem CA2 + e mg2 +). Carregar 150 μL de PBS para o canto superior direito. Aguarde 90 s ou até que o líquido começa a encher o poço direito inferior. Adicione 150 μL de PBS ao poço inferior direito e aguarde 5 min para deixar o PBS passar pelas microranhuras. Pipet 150 μL de PBS para a parte superior esquerda bem. Depois de 90 s Pipet 150 μL para o poço esquerdo inferior. Aspirar PBS do chip e, em seguida, enxaguar o chip com NSC Media (ver tabela de materiais). Carregar 150 μL de suportes para o canto superior direito. Após 90 s ou quando o líquido passa através do canal direito no poço direito mais baixo, adicione 150 μL à direita mais baixa bem. Aguarde 5 min para deixar a mídia fluir através dos microgrooves. Adicione 150 μL de mídia ao poço esquerdo superior e outro 150 μL ao poço esquerdo inferior. Incubar o chip em uma incubadora de 37 ° c com 5% de CO2 para pré-condicionar o chip até estar pronto para semente de NSCS.Nota: os chips podem ser pré-condicionados durante a noite, se necessário. 2. semeando NSCs na microplaqueta do multicompartimento Nota: Este protocolo utilizado comercialmente comprado NSCs, ao contrário de nossa publicação anterior, que começou com células de hastes embrionárias humanas5. Neste protocolo as pilhas de haste neural são chapeadas diretamente nos chips plásticos onde se diferenciam em neurônios. As células podem ser autorizadas a proliferar como NSCs (sem diferenciação) para até 2 passagens e armazenadas em frascos em líquido N2 para uso posterior. Este protocolo utiliza frascos NSC armazenados no líquido N2 após a passagem 1 ou 2. A Figura 2b mostra uma visão geral dos procedimentos de revestimento. Thaw NSCs de acordo com as instruções do fabricante.Observação: este procedimento se aplica a H9-derivado NSCs. Outras linhas celulares exigirá otimização da densidade celular. Conte a concentração celular usando um hemociômetro e ajuste usando a mídia NSC para obter uma concentração de 7 x 106 células por ml. Aspirar a mídia de cada poço do chip. Evite aspirantes a mídia dos canais principais. Pipet 5 μL da solução celular para o poço direito superior, seguido de 5 μL para o poço direito inferior (70.000 total de células). Certifique-se de que as células são pipetadas para as aberturas do canal principal. Use um microscópio para verificar se as células entraram no canal. Aguarde 5 minutos para as células aderirem à parte inferior do chip.Observação: um ou ambos os compartimentos podem ser usados para carregar células. Pipet ~ 150 μL de mídia NSC para o canto superior direito e, em seguida, 150 μL para o direito inferior bem. Repita no lado esquerdo. Incubar a 5% CO2, 37 ° c dentro de um recipiente humidificado adequado. Após 48 horas, aspirar mídia NSC dos poços e substituir com meios de diferenciação neural adicionando 150 μL para cada poço superior e cada poço inferior. Neurônios da cultura dentro de uma incubadora de 5% CO2, 37 ° c dentro de um recipiente humidificado apropriado.Nota: a mídia deve ser substituída a cada 2-3 dias. Por causa dos volumes pequenos usados na microplaqueta, a evaporação mesmo dentro de uma incubadora humidificada pode impactar substancialmente a viabilidade da pilha. Use um recipiente secundário apropriado para fornecer a umidade adicional para a cultura a longo prazo das pilhas com a microplaqueta (veja a tabela de materiais). 3. rotulagem fluorescente viral de hSC-neurônios dentro do chip Nota: o vírus múltiplo pode ser usado para etiquetar neurônios dentro do chip. As instruções abaixo descrevem o uso do vírus G-Deleted raiva-mCherry ou – eGFP. Materiais potencialmente infecciosos devem ser manipulados de acordo com as regras e regulamentos aplicáveis, podendo requerer treinamento adicional e aprovação institucional. Aqueça ~ 400 μL de meios de diferenciação neural frescos por a microplaqueta a 37 ° c. Remova 50 μL dos meios de um poço do compartimento do AXON em um tubo de centrifugação e adicione 100.000 unidades virais do vírus de raiva modificado ao tubo.Nota: descarte corretamente as pontas de Pipet gastas e os tubos de centrifugação contendo vírus. Retire os suportes de diferenciação neural restantes do compartimento axonal e coloque-o num tubo de centrifugação. Conservar a 37 ° c.Nota: Certifique-se de que os canais permanecem preenchidos com líquido. Misture o 50 μL de solução de vírus com 150 μL de meios aquecidos. Pipet 100 μL a um poço do compartimento do AXON e 100 μL ao outro compartimento do AXON bem. Incubar por 2 h dentro de uma incubadora de 37 ° c.Nota: a diferença de volumes entre os compartimentos axonal e somático ajuda a garantir que o vírus permaneça no compartimento axonal durante os tempos de infecção/incubação. Retire e elimine os suportes contendo vírus.PRECAUÇÃO: não retire o líquido dentro dos canais microfluílicos fechados. Gentilmente Pipet 75 μL de mídia fresca para um compartimento AXON bem e deixar a mídia fluir através do canal em outro AXON bem. Remova a mídia do compartimento do AXON e descarte-a corretamente. Repita as etapas 3,6 e 3,7. Encha o compartimento do AXON com os meios conservados. Pipet um adicional 50 μL de mídia fresca, se necessário, e depois devolver o chip para a incubadora. Esta mídia fresca adicional é contar para a perda de mídia durante a transferência líquida e evaporação durante o processo.Nota: a rotulagem fluorescente visível que usa estes vírus de raiva modificados ocorre por 48 h e até 8 dias depois que a morte de pilha de neurônios contaminados ocorre geralmente devido à toxicidade do vírus. A imagem latente de Neuron pode ser executada como com outras plataformas padrão da cultura (por exemplo, pratos inferiores de vidro), mas a consideração especial é precisada de manter a umidade suficiente para impedir perdas evaporativas. 4. isolamento fluídico, axotomia, e imunocoloração dentro do chip Siga o isolamento fluídico, a axotomia e a imunocoloração com o chip, conforme descrito em Nago et al.12.