사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

참고 : 그림 1A,B는 메인 채널 또는 구획, 웰 및 마이크로 홈의 위치를 포함하여 미리 조립 된 COC 칩의 회로도를 보여줍니다. 구획화된 칩은 식품 착색 염료의 분리에 의해 입증된 바와 같이구획 내에서 뚜렷한 유체 미세 환경을 확립할 수 있다(도 1C). 미리 조립된 다중 구획 칩을 준비하기 위한 프로토콜은 Nagendran 외, 섹션 112에주어진다. 1. hSC 뉴런용 멀티 컴파트먼트 칩 코팅 참고: 그림 2A는 코팅 절차에 대한 개요를 보여줍니다. 폴리-L-오르니틴을 세포 배양 등급 증류수에 용해하여 20 μg/mL 작동 용액의 칩당 600 μL의 용액을 만듭니다. 우물에서 칩을 준비 한 후 남아있는 PBS를 흡인. 피펫 팁이 채널 개구부에서 떨어져 있는지 확인하십시오.참고: 미세 유체 채널은 이 절차 의 전체 를 위해 채워진 상태로 유지되어야 합니다. 채널 / 구획에서 액체를 흡인하지 마십시오, 단지 우물. 오른쪽 상단에 폴리 L-오르니틴 작업 용액 150 μL을 적재하십시오. 90s 또는 액체가 오른쪽 아래를 잘 채우기 시작할 때까지 기다립니다. 150 μL의 용지를 오른쪽 하단에 넣고 액체가 마이크로홈을 통과할 때까지 5분 동안 기다립니다. 왼쪽 상단에 150 μL의 용지를 추가합니다. 90s를 기다린 다음 왼쪽 아래쪽에 150 μL을 추가하십시오. 칩의 홀더를 파라필름으로 감고 밤새 4°C에 놓습니다.참고: 칩과 홀더를 37°C에서 1시간 동안 놓습니다. 웰에서 용지를 흡인하여 파이펫 팁이 채널 개구부에서 멀리 떨어져 있는지 확인합니다. 오른쪽 상단에 멸균수 150 μL을 추가합니다. 90s를 기다린 다음 오른쪽 하단에 150 μL을 추가합니다. 액체가 마이크로홈을 통과할 때까지 5분 동안 기다립니다. 왼쪽 상단에 멸균수 150 μL을 넣고 90s를 기다린 다음 왼쪽 아래 웰에 150 μL을 추가합니다. 1.5-1.6단계를 반복합니다. 2°C ~ 8°C에서 천천히 라미닌을 해동하고 10 μg/mL 작동 용액을 준비한다. 라미닌 작업 용액의 150 μL을 오른쪽 상단에 잘 적재하십시오. 90s 또는 액체가 오른쪽 아래를 잘 채우기 시작할 때까지 기다립니다. 파이펫 150 μL을 오른쪽 하단에 잘. 라미닌이 마이크로 홈을 통과 할 수 있도록 5 분 기다립니다. 왼쪽 상단에 150 μL의 라미닌을 추가합니다. 90s를 기다린 다음 왼쪽 아래쪽에 150 μL을 추가하십시오. 37 °C에서 2 시간 동안 홀더 내에서 칩을 인큐베이션합니다. PBS로 칩을 헹구십시오 (Ca2 + 및 Mg2 +없이). PBS 의 150 μL을 오른쪽 상단에 잘 로드합니다. 90s 또는 액체가 오른쪽 아래를 잘 채우기 시작할 때까지 기다립니다. 150 μL의 PBS를 오른쪽 하단에 추가하고 PBS가 마이크로 홈을 통과할 때까지 5 분 동안 기다립니다. 피펫 150 μL의 PBS를 왼쪽 상단에 잘. 90 s 후 파이펫 150 μL 하부 왼쪽잘. 칩에서 PBS를 흡인한 다음 NSC 용지로 칩을 헹구는 다(재료 표참조). 150 μL의 미디어를 오른쪽 상단에 잘 로드합니다. 90년대 후 또는 오른쪽 채널을 통해 오른쪽 하단우물로 들어갈 때, 오른쪽 하단에 150 μL을 추가합니다. 미디어가 마이크로홈을 통과할 때까지 5분 정도 기다립니다. 왼쪽 상단에 150 μL의 용지를 추가하고 왼쪽 아래쪽우물에 150 μL을 추가합니다. 칩을 5% CO2로 37°C 인큐베이터에 배양하여 칩을 종자 할 준비가 될 때까지 미리 컨디셔닝합니다.참고: 필요한 경우 칩을 하룻밤 동안 사전 조절할 수 있습니다. 2. NC를 멀티컴파트먼트 칩에 시딩 참고 :이 프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 5로 시작 한우리의 이전 간행물과는 달리 상업적으로 구입 한 NSC를 사용했습니다. 이 프로토콜에서 신경 줄기 세포는 뉴런으로 분화 플라스틱 칩으로 직접 도금됩니다. 세포는 최대 2개의 대구에 대해 NSC로서 증식하도록 허용되고 추가 사용을 위해 액체 N2에 바이알에 저장될 수 있다. 이 프로토콜은 제1 또는 2항 후에 액체 N2에 저장된 NSC 바이알을 사용한다. 도 2B는 코팅 절차의 개요를 나타낸다. 제조업체의 지침에 따라 NCS를 해동합니다.참고: 이 절차는 H9 파생 NSC에 적용됩니다. 다른 세포주에는 세포 밀도 최적화가 필요합니다. 혈세포계를 사용하여 세포 농도를 계산하고 NSC 매체를 사용하여 mL당 7 x 106 세포의 농도를 얻습니다. 칩의 각 웰에서 미디어를 흡인합니다. 메인 채널에서 미디어를 흡입하지 마십시오. 피펫 5 μL의 세포 용액을 우측 위 쪽웰로, 그 뒤를 이어 우측 하단웰(총 70,000개)에 5 μL을 실시한다. 셀이 주 채널 개구부쪽으로 파이펫이 있는지 확인합니다. 현미경을 사용하여 세포가 채널에 들어갔는지 확인합니다. 셀이 칩 바닥에 부착될 때까지 5분 동안 기다립니다.참고: 셀을 로드하는 데 구획 을 사용할 수 있습니다. 피펫 ~150 μL의 NSC 용지를 오른쪽 상단에 잘 하고 150 μL을 오른쪽 아래웰로 잘 한다. 왼쪽에서 반복합니다. 적당한 가습 용기내에서 5% CO2, 37°C에서 배양한다. 48시간 후, 웰로부터 NSC 매체를 흡인하고 각 상판에 150 μL을 추가하여 신경 분화 매체로 교체하고 각 하단을 잘. 적합한 가습 용기 내에서5% CO2, 37°C 인큐베이터 내의 배양 뉴런.참고: 미디어는 2-3일마다 교체해야 합니다. 칩에 사용되는 소량으로 인해 가습 된 인큐베이터 내에서도 증발은 세포 생존에 실질적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 칩을 사용하여 세포의 장기 배양에 추가 습도를 제공하기 위해 적합한 보조 용기를 사용합니다(재료 표참조). 3. 칩 내의 hSC-뉴런의 바이러스 성 형광 라벨링 참고: 칩 내의 뉴런에 여러 바이러스를 사용하여 레이블을 지정할 수 있습니다. 아래 지침은 G 삭제 광견병 -mCherry 또는 -eGFP 바이러스의 사용을 설명합니다. 잠재적으로 전염성이 있는 물질은 해당 규칙 및 규정에 따라 처리되어야 하며 추가 교육 및 기관의 승인이 필요할 수 있습니다. 37°C로 칩당 신선한 신경 분화 매체의 ~400 μL을 따뜻하게. 축사 구획의 한 우물에서 원심 분리관으로 50 μL의 미디어를 제거한 다음 수정된 광견병 바이러스 의 100,000 개의 바이러스 단위를 튜브에 추가합니다.참고: 바이러스가 들어 있는 파이펫 팁과 원심분리기 튜브를 적절히 폐기하십시오. 축색 구획에서 나머지 신경 분화 매체를 제거하고 원심 분리튜브에 넣습니다. 37°C에서 보관하십시오.참고: 채널이 액체로 채워진 상태로 유지되도록 합니다. 바이러스 용액의 50 μL을 150 μL의 데온 매체와 혼합합니다. 파이펫 100 μL은 축산 구획의 한 웰에 잘 및 다른 축색 구획에 100 μL 잘. 37°C 인큐베이터 내에서 2시간 동안 배양한다.참고: 축색및 체세포 구획 사이의 부적 차이는 바이러스가 감염/배양 시간 동안 축색 구획에 머무르는 것을 보장하는 데 도움이 됩니다. 바이러스가 포함된 미디어를 철회하고 폐기합니다.주의: 밀폐된 미세 유체 채널 내에서 액체를 제거하지 마십시오. 신선한 용지75μL을 하나의 축산 구획에 부드럽게 파이펫하고 채널을 통해 다른 축산으로 잘 흐르게 합니다. 축색 구획에서 용지를 제거하고 올바르게 폐기하십시오. 3.6 단계와 3.7단계를 반복합니다. 축색 구획을 저장된 용지로 채웁니다. 필요한 경우 추가로 50 μL 의 신선한 매체를 피펫한 다음 칩을 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 이러한 추가적인 신선한 매체는 공정 중 액체 전달 및 증발 동안 매체의 손실을 계산하는 것이다.참고 : 이러한 수정 된 광견병 바이러스를 사용하여 눈에 보이는 형광 라벨은 감염된 뉴런의 세포 사멸이 일반적으로 바이러스 독성으로 인해 발생하는 48 시간 및 최대 8 일 동안 발생합니다. 뉴런 이미징은 다른 표준 배양 플랫폼(예: 유리 바닥 접시)과 같이 수행될 수 있지만, 증발 손실을 방지하기 위해 충분한 습도를 유지하기 위해서는 특별한 고려가 필요합니다. 4. 칩 내의 유체 절연, 축수술 및 면역 염색 Nagendran 외12에기재된 바와 같이 유체 절연, 축술 및 칩으로 면역 염색을 따르십시오.