Compartimenlise ring van menselijke stamcel-afgeleide neuronen in voorgemonteerde kunststof Microfluïdische chips

Opmerking: afbeelding 1a, B toont een schematische weergave van de voorgemonteerde COC-chip, met inbegrip van de locaties van de belangrijkste kanalen of compartimenten, putten en micro groeven. De compartimentalized chip kan verschillende fluïdische micro-omgevingen in een compartiment tot stand brengen zoals blijkt uit de isolatie van voedsel kleurstof (figuur 1c). Het protocol voor de voorbereiding van de voorgemonteerde multi-compartiment chip wordt gegeven in Nagendran et al., punt 112. 1. coating van multi-compartiment chips voor hSC-neuronen Opmerking: afbeelding 2a toont een overzicht van de coating procedures. Los poly-L-Ornithine op in celkweek-grade gedistilleerd water om 600 μL oplossing per chip van een werkoplossing van 20 μg/mL te maken. Aspireren de resterende PBS links na het voorbereiden van de chips van de putten. Zorg er bij het aanzuigen voor dat de pipetpunt uit de buurt van de opening van het kanaal komt.Opmerking: de microfluïdische kanalen moeten voor het geheel van deze procedure gevuld blijven. Niet aspireren vloeistof uit de kanalen/compartimenten, alleen de putten. Laad in de rechterbovenhoek 150 μL poly-L-Ornithine-werkoplossing. Wacht tot 90 s of totdat vloeistof begint te vullen de onderste rechtsgoed. Voeg 150 μL media toe aan de rechterbenedenhoek en wacht 5 minuten om de vloeistof door de micro groeven te laten passeren. Voeg 150 μL media toe aan de linker bovenhoek. Wacht 90 s en voeg vervolgens 150 μL toe aan de linker benedenhoek. Wikkel de houder van de chip (s) met Parafilm en plaats bij 4 °C ‘s nachts.Opmerking: plaats de chip en houder ook op 37 °C gedurende 1 uur. Aspireren van de media uit de putten, ervoor te zorgen dat de pipetpunt wordt geplaatst weg van de opening van het kanaal. Voeg 150 μL steriel water toe aan de rechterbovenhoek. Wacht 90 s en voeg vervolgens 150 μL toe aan de rechterbenedenhoek. Wacht 5 minuten om de vloeistof door de micro groeven te laten passeren. Voeg 150 μL steriel water goed toe aan de linker bovenhoek, wacht 90 s en voeg vervolgens nog eens 150 μL toe aan de linker benedenhoek. Herhaal stap 1.5-1.6. Ontdooien langzaam bij 2 °C tot 8 °C en bereiden een werkoplossing van 10 μg/mL voor. Laad 150 μL van de laminine werkoplossing in de rechterbovenhoek. Wacht tot 90 s of totdat vloeistof begint te vullen de onderste rechtsgoed. Pipet 150 μL naar de rechterbenedenhoek. Wacht 5 minuten om de laminine door de micro groeven te laten gaan. Voeg 150 μL laminine aan de linker bovenhoek goed. Wacht 90 s en voeg vervolgens 150 μL toe aan de linker benedenhoek. Inincuberen van de chip in de houder voor 2 uur bij 37 °C. Spoel de chip af met PBS (zonder CA2 + en mg2 +). Laad 150 μL PBS in de rechterbovenhoek. Wacht tot 90 s of totdat vloeistof begint te vullen de onderste rechtsgoed. Voeg 150 μL PBS aan de rechterbenedenhoek toe en wacht 5 minuten om de PBS door de micro groeven te laten gaan. Pipet de 150 μL PBS naar de linker bovenhoek. Na 90 s pipet 150 μL naar linksonder goed. Aspirate PBS van de chip en spoel de chip met NSC media (Zie tabel van de materialen). Laad 150 μL media naar de rechterbovenhoek. Na 90 s of wanneer de vloeistof via het rechterkanaal in de rechterbenedenhoek stroomt, voegt u 150 μL toe aan de rechteronderkast. Wacht 5 minuten om de media door de micro groeven te laten stromen. Voeg 150 μL media toe aan de linker bovenhoek en nog eens 150 μL naar linksonder goed. Incubreer de chip in een incubator van 37 °C met 5% CO2 om de chip vooraf te conditioneren tot ze klaar zijn om nscs te zaaien.Opmerking: chips kunnen indien nodig ‘s nachts worden geconditioneerd. 2. seeding van de NSCs in de multi compartiment chip Opmerking: dit protocol gebruikt commercieel gekochte NSCs, in tegenstelling tot onze vorige publicatie die begon met menselijke embryonale stengels cellen5. In dit protocol worden neurale stamcellen direct in de plastic chips geplateerd waar ze zich onderscheiden in neuronen. De cellen kunnen worden toegestaan om te vermenigvuldigen als NSCs (zonder differentiatie) voor maximaal 2 passages en opgeslagen in flesjes in vloeistof N2 voor verder gebruik. Dit protocol gebruikt NSC-flacons die zijn opgeslagen in vloeistof N2 na passage 1 of 2. Figuur 2b toont een overzicht van de coating procedures. De NSCs ontdooien volgens de instructies van de fabrikant.Opmerking: deze procedure is van toepassing op H9-afgeleide NSCs. Voor andere cellijnen is optimalisatie van de celdichtheid vereist. Tel de celconcentratie met behulp van een hemocytometer en pas het gebruik van NSC-media aan om een concentratie van 7 x 106 -cellen per ml te krijgen. Aspirate media van elke put van de chip. Vermijd aspirerende media uit de hoofdkanalen. Pipet 5 μL van de celoplossing naar de rechterbovenhoek, gevolgd door 5 μL naar de rechterbenedenhoek (70.000 cellen totaal). Zorg ervoor dat de cellen worden gepipetteer naar de openingen van het hoofdkanaal. Gebruik een microscoop om te controleren of cellen het kanaal hebben ingevoerd. Wacht 5 min voor cellen om te voldoen aan de onderkant van de chip.Opmerking: een of beide compartimenten kunnen worden gebruikt om cellen te laden. Pipet ~ 150 μL NSC-media naar de rechterbovenhoek en vervolgens 150 μL naar de rechterbenedenhoek. Herhaal dit aan de linkerzijde. Inincuberen bij 5% CO2, 37 °c binnen een geschikte bevoficeerde verpakking. Na 48 uur, aspireren NSC media uit de putten en vervangen door Neurale differentiatie media door het toevoegen van 150 μL aan elke top goed en elke bodem goed. Cultuur neuronen binnen een incubator van 5% CO2, 37 °c in een geschikte bevoficeerde container.Opmerking: de media moeten elke 2-3 dagen worden vervangen. Vanwege de kleine volumes die in de chip worden gebruikt, kan verdamping zelfs binnen een bevoficeerde incubator een aanzienlijke invloed hebben op de levensvatbaarheid van de cel. Gebruik een geschikte secundaire container om extra vochtigheid te bieden voor lange-termijn cultuur van cellen met de chip (Zie tabel met materialen). 3. virale fluorescerende labeling van hSC-neuronen binnen de chip Opmerking: meerdere virussen kunnen worden gebruikt om neuronen binnen de chip te labelen. Onderstaande instructies beschrijven het gebruik van G-deleted rabiës-mCherry of – eGFP virus. Potentieel besmettelijke materialen moeten worden behandeld volgens toepasselijke regels en voorschriften, en kunnen aanvullende opleiding en institutionele goedkeuring vereisen. Warm ~ 400 μL verse Neurale differentiatie media per chip tot 37 °C. Verwijder 50 μL media van de ene put van het axon-compartiment in een centrifugebuis en voeg vervolgens 100.000 virale eenheden van gemodificeerd rabiësvirus toe aan de buis.Opmerking: Gooi afgewerkte pipetpunten en centrifuge buisjes met virus goed weg. Verwijder de overgebleven Neurale differentiatie media uit het axonale compartiment en plaats ze in een centrifugebuis. Bewaren bij 37 °C.Opmerking: Zorg ervoor dat de kanalen gevuld blijven met vloeistof. Meng de 50 μL virusoplossing met 150 μL verwarmde media. Pipet-100 μL tot een goed van het axon-compartiment en 100 μL naar het andere axon-compartiment. Incuberen gedurende 2 uur binnen een incubator van 37 °C.Opmerking: het verschil in volumes tussen de axonale en somatische compartimenten zorgt ervoor dat het virus tijdens infectie/incubatie tijden in het axonale compartiment blijft. Het opnemen en afvoeren van virus bevattende media.Let op: Verwijder geen vloeistof binnen de meegeleverde microfluïdische kanalen. Pipet goed 75 μL verse media voorzichtig in een axon compartiment en laat de media door het kanaal naar andere axon stromen. Verwijder de media uit het axon-compartiment en gooi ze goed weg. Herhaal de stappen 3,6 en 3,7. Vul het axon compartiment met de opgeslagen media. Pipet keer een extra 50 μL verse media, indien nodig, en breng vervolgens de chip terug naar de incubator. Deze extra nieuwe media is om te tellen voor verlies van media tijdens vloeistof overdracht en verdamping tijdens het proces.Opmerking: zichtbare fluorescerende labeling met behulp van deze gemodificeerde rabiës virussen treedt op door 48 h en tot 8 dagen waarna de celdood van geïnfecteerde neuronen in het algemeen optreedt als gevolg van virus toxiciteit. Neuron Imaging kan worden uitgevoerd zoals bij andere standaard kweek platformen (bijv. glazen bodem schotels), maar er is speciale aandacht nodig om voldoende vochtigheid te behouden om verdampings verliezen te voorkomen. 4. fluidic isolatie, axotomie en immunokleuring binnen de chip Volg fluïdische isolatie, axotomie en immunokleuring met de chip zoals beschreven in Nagendran et al.12.