تقسيم الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية داخل رقائق Microfluidic البلاستيكية التي تم تجميعها مسبقًا

ملاحظة: الشكل 1A،B يظهر مخطط من رقاقة COC تجميعها مسبقاً، بما في ذلك مواقع القنوات الرئيسية أو المقصورات، والآبار، وmicrogrooves. رقاقة مجزأة يمكن إنشاء البيئات الدقيقة السائلة متميزة داخل مقصورة كما يدل على ذلك من خلال عزل صبغة تلوين الغذاء (الشكل1C). يتم إعطاء بروتوكول لإعداد رقاقة متعددة المقصورة التي تم تجميعها مسبقا في Nagendran وآخرون، القسم 112. 1. طلاء رقائق متعددة المقصورة للخلايا العصبية hSC ملاحظة: الشكل 2A يظهر نظرة عامة على إجراءات الطلاء. حل بولي-L-ornithine في خلية الثقافة الصف الماء المقطر لجعل 600 درجة مئوية من الحل لكل رقاقة من 20 ميكروغرام / مل حل العمل. يستنشق ال [ببس] متبقّي يسارا بعد يعدّ الرقائق من الآبار. عند aspirating، تأكد من أن طرف pipet بعيدا عن فتح القناة.ملاحظة: يجب أن تظل القنوات microfluidic ممتلئة لكامل هذا الإجراء. لا يستنشق السائل من القنوات / المقصورات، فقط الآبار. تحميل 150 درجة مئوية من بولي-L-ornithine حل العمل في أعلى اليمين جيدا. انتظر 90 ق أو حتى السائل يبدأ لملء أسفل الحق جيدا. إضافة 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أسفل اليمين جيدا وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح للسائل تمر من خلال microgrooves. إضافة 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أعلى اليسار جيدا. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 درجة مئوية إلى أسفل اليسار بشكل جيد. التفاف حامل رقاقة (ق) مع parafilm ومكان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.ملاحظة: بدلا من ذلك، ضع رقاقة وحامل في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. قم بإستنسخ وسائل الإعلام من الآبار، مما يضمن وضع طرف الأنابيب بعيدًا عن فتح القناة. أضف 150 ميكرو لتر من الماء المعقم إلى أعلى اليمين. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين بشكل جيد. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للسائل بالمرور عبر الأخاديد الدقيقة. إضافة 150 درجة مئوية من الماء المعقم إلى أعلى اليسار جيدا، والانتظار 90 ثانية ثم إضافة 150 ميكرولتر أخرى إلى أسفل اليسار جيدا. كرر الخطوات 1.5 إلى 1.6. إذابة لامينين ببطء في 2 درجة مئوية إلى 8 درجة مئوية وإعداد 10 ميكروغرام / مل حل العمل. تحميل 150 درجة مئوية من حل العمل لايمينين إلى أعلى اليمين جيدا. انتظر 90 ق أو حتى السائل يبدأ لملء أسفل الحق جيدا. Pipet 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح لللامينين بالمرور عبر الأخاديد الدقيقة. إضافة 150 درجة مئوية من اللامينين إلى أعلى اليسار جيدا. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 درجة مئوية إلى أسفل اليسار بشكل جيد. احتضان رقاقة داخل حاملها لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية. شطف رقاقة مع PBS (دون كاليفورنيا2 + وملغ2+). تحميل 150 درجة مئوية من PBS إلى أعلى اليمين جيدا. انتظر 90 ق أو حتى السائل يبدأ لملء أسفل الحق جيدا. إضافة 150 درجة مئوية من PBS إلى أسفل اليمين جيدا وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح PBS تذهب من خلال microgrooves. Pipet 150 درجة مئوية من PBS إلى أعلى اليسار جيدا. بعد 90 ثانية pipet 150 μL إلى أسفل اليسار جيدا. يستنشق PBS من رقاقة ومن ثم شطف رقاقة مع وسائل الإعلام NSC (انظر جدول المواد). تحميل 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أعلى اليمين جيدا. بعد 90 ثانية أو عندما يمر السائل من خلال القناة اليمنى في أسفل اليمين جيدا، إضافة 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للوسائط بالتدفق من خلال الأخاديد الدقيقة. إضافة 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أعلى اليسار جيدا وآخر 150 درجة مئوية إلى أسفل اليسار جيدا. احتضان رقاقة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لشرط مسبق رقاقة حتى على استعداد لبذور NSCs.ملاحظة: رقائق يمكن أن تكون مكيفة مسبقا بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر. 2. البذر NSCs في رقاقة متعددة المقصورة ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول NSCs التي تم شراؤها تجاريا، على عكس منشورنا السابق الذي بدأ مع خلايا ينبع الجنينية البشرية5. في هذا البروتوكول يتم طلاء الخلايا الجذعية العصبية مباشرة في رقائق البلاستيك حيث أنها تميز في الخلايا العصبية. يمكن السماح للخلايا بالتكاثر كـ NSCs (بدون تمييز) لمدة تصل إلى 2 ممر وتخزينها في قارورة في السائل N2 لمزيد من الاستخدام. يستخدم هذا البروتوكول قارورة NSC المخزنة في السائل N2 بعد مرور 1 أو 2. ويبين الشكل 2باء لمحة عامة عن إجراءات الطلاء. ذوبان NSCs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.ملاحظة: ينطبق هذا الإجراء على NSCs المشتقة من H9. خطوط الخلايا الأخرى سوف تتطلب تحسين كثافة الخلية. عد تركيز الخلية باستخدام مقياس الهيموكيتومات وضبط باستخدام وسائل الإعلام NSC للحصول على تركيز 7 × 106 خلايا لكل مل. يستنشق وسائل الإعلام من كل بئر من رقاقة. تجنب التصاص الوسائط من القنوات الرئيسية. Pipet 5 μL من محلول الخلية إلى أعلى اليمين جيدا، تليها 5 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا (70،000 مجموع الخلايا). تأكد من أن الخلايا يتم توجيهها نحو فتحات القناة الرئيسية. استخدم مجهرًا للتحقق من دخول الخلايا إلى القناة. انتظر 5 دقائق للخلايا التمسك الجزء السفلي من رقاقة.ملاحظة: يمكن استخدام أي من المقصورات أو كليهما لتحميل الخلايا. Pipet ~ 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام NSC إلى أعلى اليمين جيدا ثم 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا. كرر على الجانب الأيسر. حضانة في 5٪CO 2، 37 درجة مئوية داخل حاوية رطبة مناسبة. بعد 48 ساعة، يستنشق وسائل الإعلام NSC من الآبار واستبدالها بوسائط التمايز العصبي عن طريق إضافة 150 درجة مئوية إلى كل أعلى جيدا وكل أسفل جيدا. الخلايا العصبية الثقافة داخل5٪ CO 2، 37 درجة مئوية حاضنة داخل حاوية رطبة مناسبة.ملاحظة: يجب استبدال الوسائط كل 2-3 أيام. بسبب الأحجام الصغيرة المستخدمة في رقاقة، والتبخر حتى داخل حاضنة رطبة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على بقاء الخلية. استخدام حاوية ثانوية مناسبة لتوفير الرطوبة إضافية لثقافة طويلة الأجل من الخلايا مع رقاقة (انظر جدولالمواد). 3. وضع العلامات الفلورسنت الفيروسية من الخلايا العصبية hSC داخل رقاقة ملاحظة: يمكن استخدام فيروس متعددة لتسمية الخلايا العصبية داخل رقاقة. تصف التعليمات أدناه استخدام فيروس داء الكلب-mCherry g-deleted أو فيروس eGFP. ويجب التعامل مع المواد المعدية المحتملة وفقا للقواعد والأنظمة المعمول بها، وقد تتطلب تدريبا إضافيا وموافقة مؤسسية. دافئ ~ 400 درجة مئوية من وسائل الإعلام التمايز العصبية الطازجة لكل رقاقة إلى 37 درجة مئوية. إزالة 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام من بئر واحد من مقصورة محور عصبي في أنبوب الطرد المركزي ومن ثم إضافة 100،000 وحدة فيروسية من فيروس داء الكلب المعدلة إلى الأنبوب.ملاحظة: التخلص بشكل صحيح من أطراف الأنابيب المستهلكة وأنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على الفيروس. إزالة وسائل الإعلام التمايز العصبي المتبقية من المقصورة axonal ووضعها في أنبوب الطرد المركزي. يُحفظ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.ملاحظة: تأكد من أن القنوات تبقى مليئة بالسائل. خلط 50 درجة مئوية من محلول الفيروس مع 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام الدافئة. Pipet 100 درجة مئوية إلى بئر واحد من مقصورة أكسون و 100 درجة مئوية إلى مقصورة axon الأخرى بشكل جيد. حضانة لمدة 2 ساعة داخل حاضنة 37 درجة مئوية.ملاحظة: يساعد الفرق في وحدات التخزين بين المقصورات الإبطية والجسدية على ضمان بقاء الفيروس في المقصورة الإبطية أثناء أوقات العدوى/الحضانة. سحب الوسائط المحتوية على الفيروسات والتخلص منها.تحذير: لا تقم بإزالة السائل داخل القنوات الدقيقة المغلقة. بلطف pipet 75 € L من وسائل الإعلام الطازجة إلى حجرة واحدة axon جيدا والسماح للوسائل الإعلام تتدفق من خلال القناة إلى محور آخر بشكل جيد. إزالة الوسائط من حجرة axon والتخلص بشكل صحيح. كرر الخطوتين 3.6 و 3.7. املأ حجرة axon بالوسائط المحفوظة. Pipet إضافية 50 ميكرول وسائل الإعلام الطازجة، إذا لزم الأمر، ومن ثم العودة رقاقة إلى الحاضنة. هذه الوسائط الجديدة الإضافية هي لحساب نحو فقدان وسائل الإعلام أثناء نقل السائل والتبخر خلال هذه العملية.ملاحظة: يحدث وضع العلامات الفلورية المرئية باستخدام فيروسات داء الكلب المعدلة هذه بمقدار 48 ساعة وحتى 8 أيام بعد ها هي الوفاة الخلوية للخلايا العصبية المصابة تحدث بشكل عام بسبب سمية الفيروس. يمكن إجراء تصوير الخلايا العصبية كما هو الحال مع منصات الثقافة القياسية الأخرى (على سبيل المثال، الأطباق الزجاجية السفلية)، ولكن هناك حاجة إلى اعتبار خاص للحفاظ على الرطوبة الكافية لمنع فقدان التبخر. 4. عزل السائل، استئصال اللخطات، وتلطيخ المناعة داخل رقاقة اتبع العزلة المائعة، استئصال الأكسوت، وتلطيخ المناعة مع رقاقة كما هو موضح في Nagendran وآخرون12.