Paralisia induzida de natação para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans
Summary
Natação induzida por paralisia (SWIP) é um ensaio comportamental bem estabelecido, usado para estudar os mecanismos subjacentes de dopamina sinalização em Caenorhabditis elegans (c. elegans). No entanto, falta um método detalhado para realizar o ensaio. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para SWIP.
Abstract
O ensaio de natação descrito neste protocolo é uma ferramenta válida para identificar proteínas regulando o dopaminérgico sinapses. Semelhantes aos mamíferos, dopamina (DA) controla várias funções em c. elegans , incluindo atividade de aprendizagem e motor. Condições que estimulam a liberação DA (por exemplo, tratamentos de anfetamina (ANF)) ou que impedem DA autorização (por exemplo, animais faltando o transportador DA (dat-1) que são incapazes de reaccumulating para os neurônios) gerar um excesso DA extracelular em última análise, resultando em locomoção inibida. Esse comportamento é particularmente evidente quando os animais nadam na água. Na verdade, enquanto animais selvagem-tipo continuam a nadar por um longo período, dat-1 nula mutantes e selvagem-tipo tratadocom com ANF ou inibidores do transportador DA afundam até o fundo do poço e não se mexa. Esse comportamento é denominado “Natação paralisia induzida” (SWIP). Embora o ensaio SWIP está bem estabelecido, uma descrição detalhada do método está faltando. Aqui, descrevemos um guia passo a passo para executar SWIP. Para realizar o ensaio, larvas finais estágio-4 animais são colocados em uma placa de ponto de vidro contendo solução de sacarose de controle com ou sem ANF. Os animais são marcados por seu comportamento de natação ou manualmente pelo visualização sob um estereoscópio automaticamente por gravação com uma câmera montada sobre o estereoscópio. Vídeos são então analisados usando um software de rastreamento, que produz uma representação visual da frequência de debulha e paralisia na forma de mapas de calor. Ambos os sistemas manuais e automatizados garantem uma leitura facilmente quantificável de capacidade de natação dos animais e, assim, facilitam a triagem para animais com mutações dentro do sistema dopaminérgico ou para auxiliares genes. Além disso, SWIP pode ser usado para elucidar o mecanismo de ação de drogas de abuso como a ANF.
Introduction
Animais executam uma variedade de comportamentos inatos e complexas que são mediadas por neurotransmissores diferentes, coordenados por intrincados processos de sinalização. A neurotransmissor dopamina (DA) Medeia comportamentos altamente conservados entre espécies, incluindo a aprendizagem, a função motora e processamento de recompensa.
C. elegans, o nematódeo de solo com um sistema nervoso bem mapeado e relativamente simples consistindo de apenas 302 neurônios, mostra comportamentos marcadamente complexos, incluindo muitos que são regulados pelo DA como acasalamento, aprendendo, forrageamento, locomoção e postura de ovos 1. entre outras características, ciclo de vida curto, facilidade de manuseio e conservação de moléculas de sinalização, destacar as vantagens do uso de c. elegans como modelo para estudar a base neural dos comportamentos conservadas.
O hermafrodita c. elegans contém oito neurônios dopaminérgicos; Além desses, o macho contém seis pares extras para fins de acasalamento. Como em mamíferos, estes neurônios sintetizam DA e expressam o transportador DA (DAT-1), uma proteína de membrana encontrada exclusivamente em neurônios dopaminérgicos, que transporta DA liberada na fenda sináptica volta para os neurônios dopaminérgicos. Além disso, a maioria das proteínas envolvidas em cada etapa da síntese, a embalagem e a liberação DA é altamente conservada entre os vermes e os seres humanos e, como nos mamíferos, DA modula comportamentos de alimentação e locomoção em c. elegans2.
C. elegans rasteja sobre superfícies sólidas e nada com um comportamento característico de goleada na água. Curiosamente, mutantes, falta de expressão do DAT-1 (dat-1) rastejam normalmente na superfície sólida, mas não conseguem sustentar natação quando imerso em água. Este comportamento foi denominado paralisia induzida de natação, ou SWIP. Experiências anteriores demonstraram que SWIP, em parte, é causado por um excesso na fenda sináptica que, finalmente, estimula os receptores pós-sinápticos D2-like (DOP-3). Embora originalmente identificado em dat-1 nocaute animais3, SWIP também é observado no tipo selvagem animais tratados com drogas que bloqueiam a atividade de DAT (por exemplo, imipramina4) e/ou induzir DA liberação (por exemplo, anfetaminas5). Por outro lado, manipulações farmacológicas ou genéticas evitando a síntese e liberação DA e DOP-3 receptor função de bloqueio impedem SWIP6. Tomados em conjunto, estes dados já publicados estabeleceram SWIP como uma ferramenta confiável para estudar os efeitos comportamentais causados pela mutação proteínas dentro dopaminergic sinapses3,4,7 e a ser empregado para telas de genéticas para a frente para a identificação das vias reguladoras romance envolvidas em DA sinalização7,8,9,10,11,12. Além disso, fornecendo uma leitura facilmente quantificável de comportamento induzido em animais vivos, SWIP permite a elucidação dos mecanismos de ação de drogas como anfetaminas (ANF) e azaperona no dopaminérgico sinapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocolos para a realização de ensaios os SWIP têm sido descritos antes16. Aqui, descrevemos em detalhe a metodologia e a instalação para realizar o ensaio com o objetivo de fornecer um guia visual para a comunidade de c. elegans executar eficazmente SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para realizar um ensaio comportamental, SWIP, em c. elegans. Este protocolo é simples e direta com nenhum obstáculos técnicos tornando este usuário de ensaio muito amigável. No entanto, existem alguns aspectos essenciais que precisam ser considerados para efetivamente realizar o ensaio.
Deve ter cuidado para garantir que os vermes que usada para o ensaio são bem alimentados, desde que a restrição dietética afeta SWIP<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer o Dr. Osama Refai do laboratório do Dr. Randy Blakely para orientação com a análise automatizada de SWIP. Este trabalho foi financiado por fundos do NIH R01 DA042156 para LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
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