Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

La neurogenesi adulta è un processo biologico attraverso il quale nuovi neuroni nascono in un adulto e integrati nelle reti neurali esistenti¹. Nell’uomo, questo processo si verifica nel giro dentato (DG) dell’ippocampo, dove nascono circa 1.400 nuove cellule ogni giorno². Queste cellule risiedono nella parte interna della DG, che ospita una nicchia neurogenica, definita zona subgranulare (SG. Qui, ippocampal adulti cellule staminali neurali (NSC) subiscono un complesso processo di sviluppo per diventare neuroni completamente funzionali che contribuiscono alla regolazione di specifiche funzioni cerebrali, tra cui apprendimento e memoria, regolazione dell’umore, e la risposta allo stress^{3 ,4,5,6}. Per influenzare i comportamenti, le NSC adulte sono altamente regolate da vari stimoli esterni in modo dipendente dall’attività rispondendo a una serie di segnali chimici locali e distale. Questi segnali chimici includono neurotrasmettitori e neuromodulatori e agiscono in modo specifico del circuito da varie regioni del cervello. È importante sottolineare che la convergenza su circuiti di questi segnali chimici sulle NSC consente una regolazione unica e precisa dell’attivazione delle cellule staminali, della differenziazione e delle decisioni sul destino.

Uno dei modi più efficaci per interrogare la regolazione dei circuiti delle NSC adulte in vivo è associare l’analisi dell’immunofluorescenza con manipolazioni a livello di circuito. L’analisi dell’immunofluorescenza delle NSC adulte è una tecnica comunemente utilizzata, in cui gli anticorpi contro specifici marcatori molecolari vengono utilizzati per indicare lo stadio di sviluppo delle NSC adulte. Questi marcatori includono: nestina come una cellula radiale glia e marcatore progenitore precoce, Tbr2 come marcatore progenitore intermedio, e dcx come un marcatore neurone neuroblast e immaturo⁷. Inoltre, somministrando analoghi di tiofina come BrdU, CidU, Idu ed Edu, le popolazioni cellulari in fase S possono essere etichettate individualmente e visualizzate^8,9,10. Combinando questi due approcci, è possibile studiare una vasta gamma di domande che vanno dal modo in cui la proliferazione è regolata in fasi di sviluppo specifiche, al modo in cui i vari segnali influenzano la differenziazione e la neurogenesi della NSC.

Esistono diverse opzioni per manipolare efficacemente i circuiti neurali, tra cui la stimolazione elettrica, l’optogenetica e la chemiogenetica, ognuna con i propri vantaggi e svantaggi. La stimolazione elettrica comporta un’estesa chirurgia in cui gli elettrodi vengono impiantati in una regione cerebrale specifica che vengono successivamente utilizzati per trasmettere segnali elettrici per modulare una regione cerebrale mirata. Tuttavia, questo approccio manca sia di specificità cellulare che di circuito. L’optogenetica comporta la consegna di particelle virali che codificano un recettore attivo alla luce che viene stimolato da un laser emesso attraverso una fibra ottica impiantata, ma richiede ampie manipolazioni, costi generali e interventi chirurgici complessi¹¹. La chemiogenetica comporta la consegna di particelle virali che codificano un recettore di design attivato esclusivamente da farmaci di design o DREADD, che vengono successivamente attivati da un ligando specifico e biologicamente inerte noto come clozapina N-ossido (CNO)¹² . Il vantaggio di utilizzare dREADD per manipolare i circuiti neurali locali che regolano le NSC adulte sta nella facilità e nelle varie rotte dell’amministrazione CNO. Ciò consente un approccio meno dispendioso in termini di tempo con una gestione ridotta degli animali, facilmente adattabile per studi a lungo termine per modulare i circuiti neurali.

L’approccio descritto in questo protocollo è una raccolta completa di vari protocolli necessari per interrogare con successo la regolazione del circuito della neurogenesi ippocampale adulta che combina sia tecniche di immunofluorescenza che manipolazioni di circuiti usando la chemiogenetica. Il metodo descritto nel seguente protocollo è appropriato per stimolare o inibire uno o più circuiti contemporaneamente in vivo per determinare la loro funzione regolatoria sulla neurogenesi adulta. Questo approccio è meglio utilizzato se la domanda non ha bisogno di un alto grado di risoluzione temporale. Le domande che richiedono un controllo temporale preciso della stimolazione/inibizione ad una certa frequenza, possono essere affrontate meglio utilizzando l’optogenetica^13,14. L’approccio qui descritto è facilmente adattabile per studi a lungo termine con una minima manipolazione animale, soprattutto quando lo stress è una delle principali preoccupazioni.