Superexpressão de tempo não-codificante RNAs usando CRISPR ativando o Gene

Enquanto investigação biomédica mais concentrou-se transcritos codificantes de proteínas, a maioria dos genes transcritos na verdade consiste de RNA não-codificante (liberação de Ensembl 93). A pesquisa atual está começando a explorar este campo, com o número de publicações sobre lncRNAs em processos de doença crescente exponencialmente entre 2007 e 2017¹. Estas publicações demonstram que muitos lncRNAs estão associados com doença. No entanto, os mecanismos moleculares de lncRNAs estes são difíceis de estudar devido a suas diversas funções em comparação com os mRNAs. Compondo o problema de compreender o papel da lncRNAs na doença, lncRNAs exprimem-se frequentemente a codificação RNAs²níveis inferiores. Além disso, lncRNAs são mal conservadas, que limita os estudos funcionais na célula linha-humanas técnicas³. Um método para estudar o mecanismo destes genes romance é endogenamente overexpress-los em pilhas cultivadas. Estudos de superexpressão podem fornecer informações chaves sobre a função dos genes específicos e permitir aos investigadores principais vias moleculares de dissecar.

Um novo método para ativar a transcrição de genes lncRNA é baseado em tecnologias CRISPR desenvolvidas inicialmente pela Gersbach laboratório⁴. Este protocolo foi adaptado para uso em lncRNA biologia e para a expressão destes genes em outros sistemas de modelo. No CRISPR superexpressão técnica, uma proteína chamada proteína associada CRISPR 9 (Cas9) pode ser direcionada para uma sequência de DNA através de uma gRNA antisentido é reconhecido por Cas9. Normalmente, Cas9 induzirá a clivagem de DNA; no entanto, mutações em Cas9, anteriormente desenvolvido para a técnica de superexpressão, desativar esta etapa⁵. Quando um ativador transcricional é fundido a uma Cas9 “morto” (dCas9) e transformados em linhas de células, a superexpressão endógena de lncRNAs pode ser alcançado^4,6. A adição de modificações adicionais para a gRNA, permitindo que fatores transcricionais adicionais ligar a gRNA, aumentou a eficácia do sistema de ativação do gene dCas9 10 vezes⁷. Importante, foi demonstrado que a ativação transcricional requer proximidade (< 200 bp) para o transcriptional começar genes local, permitindo uma upregulation específica em áreas ricas gene⁷. Ao contrário de tecnologias de nocaute CRISPR, dCas9 e gRNA cassettes precisam ser integrado no genoma para permitir células reter uma superexpressão ao longo de várias gerações. Um método para alcançar este objectivo é usar lentivírus para integrar as fitas dCas9 e gRNA-contendo. Após a integração, a expressão do gene de lncRNA pode ser determinada.

Neste artigo, será demonstrado um protocolo para superexpressão de lncRNA em um modelo de células Jurkat T. Um procedimento passo a passo é mostrado e também pode ser adaptado para células aderentes.