Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing
Summary
Geleneksel overexpression cDNA tabanlı teknikleri sınırlı uygulanabilirliği için potansiyel işlevselliği ile birden çok ek yeri formlarını nedeniyle uzun kodlamayan RNA’ların overexpression var. Bu inceleme birden çok ek yeri değişik-in uzun kodlamayan RNA overexpress için CRISPR teknolojisini kullanan bir iletişim kuralı bildirir.
Abstract
Uzun kodlamayan RNA (lncRNA) Biyoloji Araştırma yayınları 2007 yılından bu yana katlanarak büyüyen bu alandan sayısı ile yeni ve heyecan verici bir alandır. Bu çalışmalar lncRNAs hemen hemen tüm hastalıklarda değişmiş doğruladı. Ancak, lncRNAs hastalığı bağlamında için işlevsel roller eğitim eksikliği protein ürünleri, doku özgü ifade, düşük ifade düzeyleri, splice formları karmaşıklığı ve türler arasında koruma eksikliği nedeniyle zor kalır. Species-specific ifade göz önüne alındığında, lncRNA çalışmalar genellikle hastalık süreçleri okurken insan araştırma bağlamları için kısıtlanır. LncRNAs moleküler düzeyde işlev beri lncRNA Biyoloji incelemek için bir yol lncRNA kaldırmak veya lncRNA ve ölçü hücresel etkileri overexpress etmektir. Bu makalede, lncRNAs tüp bebek overexpress için bir yazılı ve görüntülenmeyecektir protokol sunulmuştur. Temsil edici bir deney olarak, inflamatuvar barsak hastalığı, Interferon gama Antisens 1 (IFNG-AS1) ile ilişkili bir lncRNA bir Jurkat T-hücre modeli overexpressed gösterildi. Bunu yapmak için aktive kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) tekniği overexpression endojen genomik loci, etkinleştirmek için kullanılır. Aktive CRISPR tekniği transkripsiyon faktörleri lncRNA splice yükseltgen sağlam bir overexpression sağlayan bir gen transkripsiyon başlangıç siteye birtakım hedefler. Bu yordamı üç adım, yani (i) Kılavuzu RNA (gRNA) tasarım ve vektör inşaat, (ii) virüs üretimi ve iletimi ve (III) koloni tarama overexpression için içine bölünmüş. Temsilcisi bu deneme için bir IFNG-AS1 Jurkat T hücrelerinde 20-fold geliştirme gözlendi büyüktür.
Introduction
En Biyomedikal Araştırma protein kodlayıcı transkript üzerinde odaklanmıştır iken, kopya etmek genler çoğunluğu aslında kodlamayan RNA’ların (Ensembl yayın 93) oluşur. Mevcut araştırma lncRNAs katlanarak 2007 2017 ve1arasında yükselen hastalığı süreçlerde yayın numarasıyla bu alanı keşfetmeye başlıyor. Bu yayınların birçok lncRNAs hastalığı ile ilişkili olduğunu gösterir. Ancak, bu lncRNAs moleküler mekanizmaları ile karşılaştırıldığında mRNA’ların farklı işlevleri nedeniyle çalışma zordur. LncRNAs hastalığında rolünün anlaşılması sorunu bileşik, lncRNAs çoğunlukla RNA’ların2kodlama daha alt seviyelerde ifade edilir. Ayrıca, lncRNAs kötü, hangi insan-cep-satır-tabanlı teknikleri3fonksiyonel çalışmalar sınırlar korunmuş. Roman bu genlerin mekanizması çalışmaya bir yöntem endogenously onları kültürlü hücrelerde overexpress sağlamaktır. Overexpression çalışmaları belirli genler işlevi hakkında önemli bilgileri sağlar ve araştırmacılar anahtar moleküler yolları incelemek için etkinleştirin.
LncRNA genlerin transkripsiyon etkinleştirmek için yeni bir yöntem başlangıçta Gersbach laboratuvar4tarafından geliştirilen CRISPR teknolojileri temel alır. Bu iletişim kuralı kullanmak üzere lncRNA Biyoloji ve diğer model sistemleri bu genlerin ifade için adapte edilmiştir. Teknik overexpressing CRISPR içinde CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) adı verilen bir protein DNA dizisi ile Cas9 tarafından tanınan bir antianlamlı gRNA doğru yönlendirilmiş olabilirsiniz. Normalde, Cas9 DNA bölünme neden; Ancak, daha önce için overexpression tekniği, gelişmiş değil Cas9, mutasyonların bu adım5devre dışı bırakın. Ne zaman bir transkripsiyon harekete geçirmek için bir “ölü” Cas9 erimiş (dCas9) ve hücre satır içine transduced, elde4,6lncRNAs endojen overexpression olabilir. GRNA için bağlamak ek transkripsiyon faktörleri etkinleştirme gRNA, ek değişiklikler ek dCas9 gen harekete geçirmek sistem etkinliği arttı 10 kat7. Önemlisi, yakın bir konumda istemek transkripsiyon harekete geçirmek gösterilmiştir (< 200 bp) transkripsiyon için site genler, belirli bir upregulation gen zengini alanları7etkinleştirme başlatın. CRISPR nakavt teknolojileri farklı olarak, dCas9 ve gRNA kaset hücreler bir overexpression birden fazla kuşaklara korumak için izin vermek için genom entegre edilecek gerek. Bunu başarmak için bir yöntem lentiviruses dCas9 ve gRNA içeren kaset tümleştirmek için kullanmaktır. Entegrasyon sonra lncRNA gen ekspresyonu belirlenebilir.
Bu makalede, lncRNA overexpression Jurkat T-hücre modeli için bir protokol gösterilecektir. Adım adım bir yordam gösterilir ve aynı zamanda yapisan hücrelerine adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazması CRISPR aktive lncRNAs tüp bebek overexpress kullanmak için bir protokol sunar. Transcriptomic ürün işlevsel birim olduğu gibi uzun kodlamayan RNA’ların okurken bu özellikle önemli bir tekniktir. Overexpression sonra araştırmacı, bu hücreler bağlama ortakları okurken sinyal-gürültü oranı artırmak ve bile lncRNAs, daha yüksek düzeyde hücresel sonuçlarını ölçmek için kullanabilirsiniz. Ayrıca, lncRNAs sık sık CIS-genler üzerinde hareket gibi bu endojen overexpression teknik e?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. RO1 DK60729 ve P30 DK 41301-26 tarafından desteklenir. D.P. bir Crohn & kolit Vakfı (CCFA) kariyer geliştirme Ödülü tarafından tedavi desteklenmektedir: sindirim hastalıkları Araştırma Merkezi (DDRC) DK41301 ve UCLA klinik ve çevirim Bilim Enstitüsü (CTSI) UL1TR0001881. UCLA Viroloji çekirdek Merkezi, AIDS Araştırma (CFAR tarafından) finanse edildi 5 P 30 AI028697 verin. UCLA entegre moleküler çekirdek tedavi/P30 tarafından desteklenen teknolojilerin DK041301 verin. Bu eser de UCLA AIDS Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
