Экспрессирующих длиной некодирующих РНК с помощью активации генов ТРИФОСФАТЫ
Summary
Традиционные на основе cDNA гиперэкспрессия методы имеют ограниченную применимость для гиперэкспрессия длиной некодирующих РНК за счет их несколько форм сращивания с потенциальными возможностями. Этот обзор докладов протокол, с помощью технологии ТРИФОСФАТЫ для overexpress несколько вариантов соединения длиной некодирующих РНК.
Abstract
Длиной некодирующих биологии РНК (lncRNA) является новой и интересной области исследований, количество публикаций из этой области растет экспоненциально с 2007 года. Эти исследования подтвердили, что lncRNAs изменяются в практически всех заболеваний. Однако изучая функциональные роли для lncRNAs в контексте болезнь остается сложным вследствие нехватки белковых продуктов, ткани конкретного выражения, низкой выражение уровня, сложностей в сращивания формы и отсутствие сохранения среди видов. Учитывая вегетационных выражение, lncRNA исследования, часто ограничиваются исследований человеческого контекста при изучении процессов болезни. Поскольку lncRNAs функционировать на молекулярном уровне, одним из способов вскрыть lncRNA Биология является либо удалить lncRNA или overexpress lncRNA и измерения клеточном эффекты. В этой статье представлены письменные и визуализировать протокол к overexpress lncRNAs в пробирке. Как представитель эксперимент lncRNA, связанных с воспалительным заболеванием кишечника, интерферон гамма Antisense 1 (IFNG-AS1), показано оверэкспрессировали в модели Jurkat Т-клеток. Для этого, активируя кластерных регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) техника используется для включения гиперэкспрессия на эндогенных локусов генома. Метод активации ТРИФОСФАТЫ цели набор факторов транскрипции на сайт transcriptional начала гена, позволяя надежные гиперэкспрессия множественных форм сплайс lncRNA. Эта процедура будет разбить на три этапа, а именно (i) руководство РНК (gRNA) дизайн и вектор строительства, (ii) вирус поколения и трансдукции и (iii) колонии скрининга для гиперэкспрессия. Для этого представитель эксперимента больше чем кратной повышение в IFNG-AS1 в Jurkat Т-клеток наблюдалось.
Introduction
Хотя наиболее биомедицинских исследований сосредоточено на кодирвоания протеина стенограммы, большинство транскрипции генов на самом деле состоит из некодирующих РНК (Ensembl релиз 93). Текущие исследования начинают исследовать это поле, количество публикаций по lncRNAs в процессах заболеваний растет экспоненциально между 2007 и 2017-1. Эти публикации показывают, что многие lncRNAs, связанные с болезнью. Однако молекулярные механизмы этих lncRNAs трудно учиться из-за их различных функций по сравнению с мРНК. Усугубляет проблему понимания роли lncRNAs в болезни, lncRNAs часто выражаются на более низких уровнях, чем кодирования RNAs2. Кроме того lncRNAs плохо сохраняются, что ограничивает функциональные исследования в3человека клетки линии-на основе методов. Один из способов изучить механизм этих новых генов является эндогенно overexpress их в культивируемых клеток. Гиперэкспрессия исследования может предоставить ключевую информацию о функции специфических генов и позволяют исследователям анализировать основные молекулярные пути.
Новый метод для того чтобы активировать транскрипцию генов lncRNA основана на ТРИФОСФАТЫ технологий, первоначально разработанных в лаборатории Gersbach4. Этот протокол был адаптирован для использования в lncRNA биологии и экспрессии этих генов в других системах модель. В ТРИФОСФАТЫ, экспрессирующих технику белок, называемый ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) могут быть направлены на последовательность ДНК через антисмысловых gRNA, который распознается Cas9. Как правило Cas9 будет стимулировать расщепления ДНК; Однако мутации в Cas9, ранее разработанных для гиперэкспрессия технику, деактивировать этот шаг5. Когда transcriptional активатор сливается с «мертвых» Cas9 (dCas9) и преобразованы в клеточных линий, эндогенного Сверхэкспрессия lncRNAs может быть достигнуто в4,6. Добавление дополнительных изменений gRNA, включение дополнительных транскрипционный анализ факторов для привязки к gRNA, повышает эффективность активации системы dCas9 гена десятикратного7. Важно отметить, что было продемонстрировано, что transcriptional активации требует непосредственной близости (< 200 bp) для transcriptional запустить сайт генов, включение конкретных upregulation в Джин богатые районы7. В отличие от ТРИФОСФАТЫ нокаут технологий dCas9 и gRNA кассеты должны быть интегрированы в геном для клеток сохранить гиперэкспрессия через несколько поколений. Один из способов добиться этого заключается в использовании lentiviruses для интеграции dCas9 и содержащих gRNA кассеты. После интеграции можно определить выражение гена lncRNA.
В этой статье будет продемонстрирована протокол для lncRNA гиперэкспрессия в модели Jurkat Т-клеток. Пошаговая процедура показана и также может быть адаптирована для адэрентных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта рукопись представляет собой протокол для использования активации ТРИФОСФАТЫ для overexpress lncRNAs в пробирке. Это особенно важно техника при изучении длиной некодирующих РНК как продукт транскриптомики является функциональное подразделение. После гиперэкспрессия исследователь может ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. поддерживается RO1 DK60729 и P30 ДК 41301-26. Д.п. поддерживается крона и колит фонда (CCFA) карьеры премии в области развития, лечения: DK41301 центр исследований пищеварением заболеваний (DDRC) и клинических UCLA на всей территории отеля и в трансляционной институт науки (CTSI) UL1TR0001881. UCLA вирусологии ядро финансировалась центром СПИДа исследований (CFAR) предоставить 5P 30 AI028697. UCLA комплексной молекулярных технологий, которую ядро было поддержано CURE/P30 Грант DK041301. Эта работа также была поддержана UCLA СПИДа института.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
