Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

가장 생물 의학 연구는 단백질 코딩 성적표를 중점적으로, 베낀된 유전자의 대다수는 실제로 noncoding RNAs (합 자료 93)의 구성 됩니다. 현재 연구는 2007 년과 2017¹사이 기 하 급수적으로 상승 하는 질병 과정에서 lncRNAs에 간행물의 수와 함께이 필드를 탐험 시작 됩니다. 이 간행물은 많은 lncRNAs 질병와 관련 된 보여 줍니다. 그러나,이 lncRNAs의 분자 메커니즘은 mRNAs에 비해 그들의 다양 한 기능으로 인해 공부 하기가 어렵습니다. LncRNAs 질병에서의 역할 이해의 문제를 다중, lncRNAs 주로 코딩 RNAs²보다 하위 수준에 표시 됩니다. 또한, lncRNAs는 가난 하 게 보존, 인간의 세포 라인 기반 기술³기능 연구를 제한 하. 이 비 발한 유전자의 메커니즘을 연구 한 방법은 endogenously 경작된 한 세포에 overexpress 것입니다. Overexpression 학문 특정 한 유전자의 기능으로 중요 한 정보를 제공 하 고 연구원은 주요 분자 경로 해 부를 수 있도록 수 있습니다.

LncRNA 유전자의 전사를 활성화 하는 새로운 방법은 게르 바흐 연구소⁴에 의해 처음 개발 하는 CRISPR 기술을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 lncRNA 생물학에서 사용 하 고 다른 모델 시스템에서이 유전자의 표현에 대 한 적응 되었습니다. 기술 overexpressing CRISPR에서 CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 이라고 불리는 단백질 Cas9에 의해 인식 되는 센스 gRNA 통해 DNA 시퀀스를 향해 이동 수 있습니다. 일반적으로, Cas9 DNA 분열;을 유발 한다 그러나, Cas9, 이전 overexpression 기술에 대 한 개발에 변이이 단계⁵를 비활성화 합니다. “죽은” Cas9에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 때 (dCas9) 셀 라인으로 불리고, lncRNAs의 생 overexpression 수 달성된^4,6. DCas9 유전자 활성화 시스템의 효능을 증가 하는 gRNA, gRNA에 바인딩할 추가 transcriptional 요소 사용에 대 한 추가 수정 추가 사진⁷. 중요 한 것은, 그것 transcriptional 활성화 근접에서는 시연 했다 (< 200 bp)는 transcriptional 시작 사이트 유전자, 유전자 풍부한 지역⁷에 특정 upregulation를 사용. CRISPR 녹아웃 기술, 달리 dCas9 및 gRNA 카세트는 여러 세대에 걸쳐 overexpression를 유지 하기 위해 셀 수 있도록 게놈으로 통합 될 필요가 있다. 이를 위해 한 가지 방법은 dCas9 및 gRNA 포함 된 카세트를 통합 lentiviruses를 사용 하는 것입니다. 통합 후 lncRNA 유전자 발현을 확인할 수 있습니다.

이 문서에서는, lncRNA overexpression Jurkat T 세포 모델에 대 한 프로토콜 시연 됩니다. 단계별 절차는 표시 되 고 또한 부착 셀에 적용할 수 있습니다.