Overexpressing RNAs Noncoding זמן באמצעות הפעלת גנים CRISPR
Summary
טכניקות ביטוי מסורתיים מבוססי cDNA יש של תחולה מוגבלת עבור ביטוי של RNAs noncoding זמן עקב שלהם טפסים splice מרובים עם פונקציונליות פוטנציאליים. ביקורת זו דוחות באמצעות טכנולוגיית CRISPR את overexpress וריאציות splice מרובים של RNA זמן noncoding פרוטוקול.
Abstract
זמן noncoding RNA (lncRNA) ביולוגיה היא שדה חדש ומרגש של מחקר, עם מספר פרסומים משדה זה גדלה אקספוננציאלית מאז 2007. מחקרים אלה אישרו כי lncRNAs הם שינו כמעט כל מחלות. עם זאת, ללמוד את התפקידים פונקציונלי עבור lncRNAs בהקשר של מחלה נשאר קשה עקב חוסר חלבון מוצרים, ביטוי רקמות ספציפיות, רמות הביטוי נמוך, המורכבויות טפסים splice, חוסר שימור בין המינים. נתון הביטוי תלויי מין, מחקרים lncRNA מוגבלים לעיתים קרובות מחקר האנושית בהקשרים כשלמדתי תהליכי מחלה. מאז lncRNAs לתפקד ברמה המולקולרית, אחת הדרכים לנתח lncRNA ביולוגיה היא להסיר את lncRNA או overexpress ההשפעות הסלולר lncRNA ולמדוד. במאמר זה, מוצג פרוטוקול בכתב, דמיינו overexpress lncRNAs במבחנה. בתור ניסוי נציג lncRNA הקשורים עם מחלות מעי דלקתיות, אינטרפרון גמא Antisense 1 (IFNG-AS1), מוצג כדי להיות overexpressed במודל Jurkat T-cell. כדי לעשות זאת, הטכניקה הפעלת באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) משמש כדי לאפשר ביטוי-לוקוסים גנומית אנדוגני. הפעלת הטכניקה CRISPR מטרות ערכה של גורמי שעתוק לאתר התחלה תעתיק של הגן, מתן אפשרות של ביטוי חזקים של טפסים splice lncRNA מרובים. הליך זה ניתן לפרק לתוך שלושה שלבים, כלומר RNA (gRNA) (i) מדריך בנייה ועיצוב וקטור, דור (ii) וירוס, התמרה חושית ו- (iii) המושבה הקרנה של ביטוי. עבור ניסוי נציג של יותר מאשר שיפור 20-fold IFNG-AS1 בתאי Jurkat T נצפתה.
Introduction
בעוד המחקר הביו-רפואי ביותר התמקדה תעתיקים חלבונים, רוב הגנים משועתקים למעשה מורכבת noncoding RNAs (שחרור Ensembl 93). המחקר הנוכחי מתחיל לחקור את השדה עם מספר פרסומים על lncRNAs בתהליכי מחלה עולה אקספוננציאלית בין 2007 ו 20171. פרסומים אלה מדגימים כי lncRNAs רבים הקשורים במחלה. עם זאת, המנגנון המולקולרי של lncRNAs האלה קשים ללמוד בשל הפונקציות מגוונות שלהם לעומת mRNAs. הרכבה הבעיה של להבין את התפקיד של lncRNAs במחלה, lncRNAs מבוטאים לעיתים קרובות ברמות נמוכות יותר קידוד RNAs2. בנוסף, lncRNAs לקוי נשמרים, אשר מגביל את המחקרים פונקציונלי טכניקות האדם תא קו-מבוססת על3. שיטה אחת כדי לחקור את המנגנון של הגנים האלה הרומן היא endogenously overexpress אותם בתאים בתרבית. מחקרים ביטוי יכול לספק מידע מפתח הפונקציה של גנים ספציפיים ולאפשר חוקרים לנתח מפתח מסלולים מולקולריים.
שיטה חדשה להפעלת שעתוק של גנים lncRNA מבוססת על טכנולוגיות CRISPR שפותחה בתחילה על ידי מעבדה Gersbach4. פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש בביולוגיה lncRNA והן עבור הביטוי של גנים אלה במערכות אחרות מודל. ב- CRISPR overexpressing טכניקה, חלבון הנקרא CRISPR-הקשורים חלבון 9 (Cas9) יכול להיות מופנה כלפי רצף הדנ א באמצעות gRNA antisense מזוהה על-ידי Cas9. בדרך כלל, Cas9 יניעו ביקוע DNA; עם זאת, מוטציות בגן Cas9, שפותחו בעבר ביטוי הטכניקה, לבטל את שלב5. מתי מפעיל גנים ברמת השעתוק היא דבוקה של Cas9 “מת” (dCas9) transduced לתוך שורות תאים, ביטוי אנדוגני של lncRNAs יכול להיות מושגת4,6. התוספת של שינויים נוספים gRNA, הפעלת גורמים נוספים תעתיק לקשור gRNA, הגדילו את היעילות של מערכת ההפעלה של הגן dCas9 10-fold7. חשוב, הוכח כי הפעלת גנים ברמת השעתוק דורשת הקרבה (< 200 bp) תעתיק להפעיל אתר הגנים, הפעלת קולטנים upregulation ספציפיים של ג'ין עשיר אזורים7. בניגוד CRISPR טכנולוגיות נוקאאוט, קלטות dCas9 ו- gRNA צריך להיות משולב לתוך הגנום כדי לאפשר תאים לשמור על ביטוי דורות מרובים. שיטה אחת כדי להשיג זאת היא להשתמש lentiviruses כדי לשלב את dCas9 ואת gRNA-המכילים הקלטות. לאחר שילוב, בביטוי הגן lncRNA יכול להיקבע.
במאמר זה, תודגמנה פרוטוקול עבור ביטוי lncRNA במודל Jurkat T-cell. הליך שלב אחר שלב מוצג, ניתן להתאים גם תאים חסיד.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מציג פרוטוקול להצפנה באמצעות הפעלת CRISPR overexpress lncRNAs במבחנה. זוהי טכניקה חשובה במיוחד כאשר ללמוד RNAs noncoding זמן כפי שהמוצר transcriptomic היא היחידה הפונקציונלית. לאחר ביטוי, החוקר יכול, ואז להשתמש תאים אלה להגדיל את יחס אות לרעש כשלמדתי האיגוד שותפים, אפילו למדוד את התוצאות הסלולר של רמות גב…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
סי. פי נתמך ע י 41301 RO1 DK60729 ו- P30 DK-26. D.P. נתמך על-ידי קרוהן & קוליטיס קרן (CCFA) הקריירה פיתוח פרס, התרופה: מרכז מחקר מחלות עיכול (DDRC) DK41301, UCLA קליני ואת מכון המדע Translational (CTSI) UL1TR0001881. ליבת וירולוגיה UCLA מומן על ידי מרכז של איידס המחקר (כפר) להעניק 30 P 5 AI028697. UCLA משולב מולקולרית טכנולוגיות הליבה נתמכה על ידי התרופה/P30 הענק DK041301. עבודה זו גם נתמך על ידי המכון איידס UCLA.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
